Voie de signalisation NF-kappaB dans la régulation de la transcription du VIH-1 et du HCMV dans les macrophages

par Kashif Aziz Khan

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Georges Herbein.


  • Résumé

    Le facteur de transcription NF-kappaB constitue une famille de cinq protéines qui régule l'expression d'un grand nombre de gènes impliqués dans diverses fonctions biologiques, notamment l'immunité, l'inflammation, le développement et l'apoptose. Les membres de la famille NF-kappaB comprennent les protéines p65, RelB, c-Rel, p50 et p52 qui forment des homo- et des hétérodimères. Le facteur de transcription NF-kappaB est normalement séquestré dans le cytoplasme, en association avec les membres de la famille IkB (inhibitor of kappa B). La phosphorylation et l'ubiquitination médiée par IKK (IkB Kinase) conduisent à la dégradation de IkB et à la translocation de NF-kappaB dans le noyau où la régulation transcriptionnelle des gènes cibles a lieu. L'activation de IKK est tributaire entre autres des protéines adaptatrices TRAF et RIP. Ainsi la voie de signalisation NF-kappaB se compose des dimères NF-kappaB, des protéines IkB, du complexe IKK et des protéines adaptatrices. L'activation de la voie de signalisation NF-kappaB est fréquente au cours des infections virale. NF-kappaB étant un composant essentiel de la réponse immunitaire innée antivirale, il participe à la réaction de l'hôte contre les agents pathogènes. Les virus ont développé des stratégies pour moduler la voie de signalisation NF-kappaB en leur faveur notamment pour faciliter leur réplication, empêcher l'apoptose des cellules infectées et favoriser l'échappement à la réponse immunitaire. Par ailleurs, les virus ont incorporé des sites de fixation de NF-kappaB dans leurs promotteurs. Ainsi l'activation de NF-kappaB résulte en une transactivation des promoteurs viraux et en une transcription virale augmentée. En effet de nombreux virus et certaines protéines virales activent ou inhibent la voie de signalisation NF-kappaB pour créer un environnement favorable au développement du cycle viral dans la cellule hôte. Dans la première partie de notre étude, nous nous sommes intéressés au rôle du facteur de transcription NF-kappaB dans la transcription du cytomégalovirus humain (HCMV) en infectant des macrophages dérivés de monocytes sanguins (MDMs). Les macrophages jouent un rôle important dans la pathogenèse liée à HCMV et l'effet de l'infection virale sur la signalisation cellulaire dans ces cellules reste peu documenté. Nous avons montré que les souches virales AD169 (souche de laboratoire) et HCMV-DB (souche issue d'un isolat clinique) pouvaient se multiplier dans des cultures de cellules primaires MDMs mais que le titre viral demeurait inférieur à celui observé dans des cellules plus permissives telles que les fibroblastes de la lignée MRC5. Etant donné que le facteur de transcription NF-kappaB joue un rôle essentiel dans la réplication virale notamment par la transactivation du promoteur viral très précoce IE et du gène tardif viral, nous avons étudié l'activation et la composition du complexe NF-kappaB dans des cellules MDMs et des fibroblastes MRC5 infectés par HCMV. Par des techniques de retard sur gel (EMSA) et de colorimétrie (Microwell colorimetric NF-kappaB assay), nous avons montré que l'infection par HCMV entraînait une activation du complexe p52/Bcl-3 dans les cellules MDMs alors qu'il activait le complexe classique NF-kappaB p50/p65 dans les fibroblastes de la lignée MRC5. L'utilisation des cellules monocytoïdes U937 transfectées par un vecteur pCMV-Luc, vecteur d'expression de la luciférase sous la dépendance du promoteur viral du gène très précoce EA (MIEP), nous a permis de montrer que le complexe p52/Bcl-3 activait le promoteur viral MIEP. Par la technique d'immunoprécipitation de chromatine (technique ChIP), nous avons mis en évidence l'interaction entre le complexe p52/Bcl-3 et le MIEP dans les cellules MDMs infectées par le HCMV. Ainsi, l'activation du complexe NF-kappaB p52/Bcl-3 dans les cellules MDMs pourrait être à l'origine de la réplication limitée d'HCMV dans ces cellules. Dans la deuxième partie de notre étude, nous avons étudié le rôle de NF-kappaB dans la transcription du VIH-1 dans les cellules MDMs lors de la co-infection par le virus de l'hépatite C (VHC) et le VIH-1. L'infection par VIH favorise l'évolution de l'hépatite C chronique et augmente la charge virale VHC, mais le rôle deu VHC sur la réplication virale de VIH reste mal connu. Les cellules mononuclées périphériques (PBMC) sont permissives aux virus VIH et VHC et peuvent constituer un réservoir extra-hépatique de virions. Il a été montré que la transcription de NF-kappaB est activée lors de l'infection par VHC et VIH-1. Nous nous sommes proposés d'étudier le rôle de NF-kappaB sur la transcription du VIH-1 dans les cellules MDMs lors d'une co-infection VHC/VIH-1. Des études préliminaires conduites dans notre laboratoire ont montré que la charge virale VIH-1 était plus élevée dans les cellules PBMC et MDMs provenant de sujets co-infectés que chez les sujets mono-infectés. Nous avons observé, in vitro, que les protéines Nef du VIH-1 et Core du VHC activent le complexe p50/p65 de NF-kappaB dans les cellules MDM. Grâce à une technique reposant sur l'expression de la luciférase, nous avons montré que les deux protéines activaient la transcription du LTR du VIH-1. Nous avons également démontré que les protéines Nef et Core activent la réplication du VIH-1 dans les cellules promonocytaires chroniquement infectés U1. De plus, ces protéines stimulaient également la réplication du VIH-1 dans des macrophages primaires infectés par le virus. Par conséquent, les deux protéines Nef et Core pourraient favoriser la formation de réservoirs cellulaires contenant les deux virus. L'ensemble de ces études nous a permis de mieux comprendre le rôle de NF-kappaB dans la transcription virale au sein des macrophages.


  • Résumé

    The mammalian nuclear factor-kB (NF-kB) is a family of live DNA-binding proteins that regulate expression of a large number of genes involved in diverse biological functions including immunity, inflammation, development and apoptosis. Members of NF-kappaB family include p65 (RelA), RelB, c-Rel, p50 (NF-kappaB) and p52 (NF-kappaB2), which are found as homo-and heterodimers. The transcription factor NF-kappaB is normally sequestred in the cytoplasm in association with the members of the inhibitor of kappa B (IkB) family. IkB Kinase (IKK) mediated phosphorylation, ubiquitination and degradation of IkB frees NF-kappaB to translocate to the nucleus to regulate the transcription of target genes. Activation of IKK is dependent upon intracellular adapter proteins such as TRAF and RIP. Thus NF-kappaB pathway consists of NF-kappaB dimers, IkB proteins, IKK complex and intracellular adapter proteins. Activation of NF-kappaB is a common feature during viral infections. NF-kappaB is an essential component of innate antiviral immune response and is a part of the protective reaction of the host against pathogens. Viruses have evolved strategies to modulate NF-kappaB signaling pathway for their own benefit especially to facilitate their replication, prevent apoptosis of infected cells and evasion of immune responses. In addition a number of viruses contain NF-kappaB binding sites in their promoters. Thus activation of NF-kappaB results in the transactivation of viral promoters, thus enhancing viral transcription and replication. In fact, several viruses and a number of viral proteins have been reported either to stimulate or inhibit NF-kappaB activation to create an environment for successful viral life cycle in the host cell. In the first part of our study we studied the role of NF-kappaB in the transcription and replication of HCMV in primary human monocyte-derived macrophages (MDMs). Monocytes/macrophages are key cells in the pathogenesis of human cytomegalovirus (HCMV) infection, but the in vitro rate of viral production in MDMs is considerably lower than in fibroblasts. Considering that the NF-kappaB signaling pathway is potentially involved in the replication strategy of HCMV through efficient transactivation of the major immediate-early promoter (MIEP), efficient viral replication, and late gene expression, we investigated the composition of the NF-kappaB complex in HCMV-infected MDMs and fibroblasts. Preliminary studies showed that HCMV could grow in primary MDMs culture but that the viral titer in culture supernatants was lower than that observed in the supernatants of more permissive MRC5 fibroblasts. EMSA and microwell colorimetric NF-kappaB assay demonstrated that HCMV infection of MDMs increased p52 binding activity without activating the canonical p50/p65 complex. Moreover, Bcl-3 was up-regulated and was demonstrated to associate with p52, indicating p52/Bcl-3 complexes as the major component of the NF-kappaB complex in MDMs. Luciferase assays in promonocytic U937 cells transfected with an MIEP-luciferase reporte construct demonstrated MIEP activation in response to p52 and Bcl-3 overexpression. Chromatin immunoprecipitation assay demonstrated that p52 and Bcl-3 bind the MIEP in acutely HCMV-infected MDMs. In contrast, HCMV infection of MRC5 fibroblasts resulted in activation of p50/p65 heterodimers. Thus, activation of p52/Bcl-3 complexes in MDMs and p50/p65 heterodimers in fibroblasts in response to HCMV infection might explain the low-level growth of the virus in MDMs vs efficient growth in fibroblasts. In the second part of our study, we studied the role of NF-kappaB in the transcription and replication of HIV-1 in macrophages during HIV-1/hepatitis C virus (HCV) coinfection. HIV infection favors the progression of HCV disease and enhances the viral load of HCV but the effect of HCV on replication of HIV-1 is not well studied. Macrophages are permissive to HCV and HIV-1 infection so can constitute extra-hepatic reservoir of these viruses. As transcription factor NF-kappaB is activated during HIV-1 and HCV infection we studied the role of NF-kappaB in the transcription of HIV-1 in MDMs. Preliminary studies from our laboratory demonstrate higher levels of HIV-1 viral load in MDMs isolated from the peripheral blood of HIV-1/HCV coinfected subjects in comparison with HIV-1 monoinfected patients. To assess the potential role of HIV-1 Nef and HCV Core proteins in this phenomenon, we studied their respective role regarding NF-kappaB activation and HIV-1 replication in primary macrophages. Following the treatment of MDMs with exogenous HIV-1 Nef and HCV Core proteins, we observed activation of NF-kappaB which consist of p50/p65. Consistently, degradation of NF-kappaB, and phosphorylation of IKKalpha, IKK beta was observed in response to both HIV-1 Nef and HCV Core proteins. In addition, HIV-1 Nef and HCV Core proteins stimulated synergistically the HIV-1 long terminal repeat (LTR), and subsequently enhanced HIV-1 replication in both chronically infected promonocytic U1 cells and acutely HIV-1 infected MDMs. Therefore, our results indicate that HIV-1 Nef and HCV Core proteins synergise to enhance NF-kappaB activation and HIV-1 replication in primary macrophages and thereby could fuel the progression of the HIV-1 disease in HIV/HCV coinfected patients. All together our results have important implication in terms of viral persistence and formation of viral reservoirs in macrophages during chronic viral infections.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (273 f.)
  • Notes : Thèse disponible en texte intégral (au format PDF) dans la base de données ARTUR-FC, accessible à partir de l’adresse www.scd.univ-fcomte.fr puis lien vers ARchive des Travaux Universitaires et de la Recherche - Franche-Comté (= ARTUR-FC : nom de la base des productions scientifiques de l Université de Franche-Comté)
  • Annexes : Bibliogr. p. 230-273 et en fin des articles

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  • Bibliothèque : Bibliothèque universitaire Santé (Besançon).
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : QW.168.5.H6.KHA.2010
  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire de santé (Paris). Pôle pharmacie, biologie et cosmétologie.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : MFTH 9024
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