Thèse soutenue

FR
Accès à la thèse
Auteur / Autrice : Kashif Aziz Khan
Direction : Georges Herbein
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
Date : Soutenance en 2010
Etablissement(s) : Besançon
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Homme, environnement, santé (Besançon2000-2012)

Résumé

FR  |  
EN

Le facteur de transcription NF-kappaB constitue une famille de cinq protéines qui régule l'expression d'un grand nombre de gènes impliqués dans diverses fonctions biologiques, notamment l'immunité, l'inflammation, le développement et l'apoptose. Les membres de la famille NF-kappaB comprennent les protéines p65, RelB, c-Rel, p50 et p52 qui forment des homo- et des hétérodimères. Le facteur de transcription NF-kappaB est normalement séquestré dans le cytoplasme, en association avec les membres de la famille IkB (inhibitor of kappa B). La phosphorylation et l'ubiquitination médiée par IKK (IkB Kinase) conduisent à la dégradation de IkB et à la translocation de NF-kappaB dans le noyau où la régulation transcriptionnelle des gènes cibles a lieu. L'activation de IKK est tributaire entre autres des protéines adaptatrices TRAF et RIP. Ainsi la voie de signalisation NF-kappaB se compose des dimères NF-kappaB, des protéines IkB, du complexe IKK et des protéines adaptatrices. L'activation de la voie de signalisation NF-kappaB est fréquente au cours des infections virale. NF-kappaB étant un composant essentiel de la réponse immunitaire innée antivirale, il participe à la réaction de l'hôte contre les agents pathogènes. Les virus ont développé des stratégies pour moduler la voie de signalisation NF-kappaB en leur faveur notamment pour faciliter leur réplication, empêcher l'apoptose des cellules infectées et favoriser l'échappement à la réponse immunitaire. Par ailleurs, les virus ont incorporé des sites de fixation de NF-kappaB dans leurs promotteurs. Ainsi l'activation de NF-kappaB résulte en une transactivation des promoteurs viraux et en une transcription virale augmentée. En effet de nombreux virus et certaines protéines virales activent ou inhibent la voie de signalisation NF-kappaB pour créer un environnement favorable au développement du cycle viral dans la cellule hôte. Dans la première partie de notre étude, nous nous sommes intéressés au rôle du facteur de transcription NF-kappaB dans la transcription du cytomégalovirus humain (HCMV) en infectant des macrophages dérivés de monocytes sanguins (MDMs). Les macrophages jouent un rôle important dans la pathogenèse liée à HCMV et l'effet de l'infection virale sur la signalisation cellulaire dans ces cellules reste peu documenté. Nous avons montré que les souches virales AD169 (souche de laboratoire) et HCMV-DB (souche issue d'un isolat clinique) pouvaient se multiplier dans des cultures de cellules primaires MDMs mais que le titre viral demeurait inférieur à celui observé dans des cellules plus permissives telles que les fibroblastes de la lignée MRC5. Etant donné que le facteur de transcription NF-kappaB joue un rôle essentiel dans la réplication virale notamment par la transactivation du promoteur viral très précoce IE et du gène tardif viral, nous avons étudié l'activation et la composition du complexe NF-kappaB dans des cellules MDMs et des fibroblastes MRC5 infectés par HCMV. Par des techniques de retard sur gel (EMSA) et de colorimétrie (Microwell colorimetric NF-kappaB assay), nous avons montré que l'infection par HCMV entraînait une activation du complexe p52/Bcl-3 dans les cellules MDMs alors qu'il activait le complexe classique NF-kappaB p50/p65 dans les fibroblastes de la lignée MRC5. L'utilisation des cellules monocytoïdes U937 transfectées par un vecteur pCMV-Luc, vecteur d'expression de la luciférase sous la dépendance du promoteur viral du gène très précoce EA (MIEP), nous a permis de montrer que le complexe p52/Bcl-3 activait le promoteur viral MIEP. Par la technique d'immunoprécipitation de chromatine (technique ChIP), nous avons mis en évidence l'interaction entre le complexe p52/Bcl-3 et le MIEP dans les cellules MDMs infectées par le HCMV. Ainsi, l'activation du complexe NF-kappaB p52/Bcl-3 dans les cellules MDMs pourrait être à l'origine de la réplication limitée d'HCMV dans ces cellules. Dans la deuxième partie de notre étude, nous avons étudié le rôle de NF-kappaB dans la transcription du VIH-1 dans les cellules MDMs lors de la co-infection par le virus de l'hépatite C (VHC) et le VIH-1. L'infection par VIH favorise l'évolution de l'hépatite C chronique et augmente la charge virale VHC, mais le rôle deu VHC sur la réplication virale de VIH reste mal connu. Les cellules mononuclées périphériques (PBMC) sont permissives aux virus VIH et VHC et peuvent constituer un réservoir extra-hépatique de virions. Il a été montré que la transcription de NF-kappaB est activée lors de l'infection par VHC et VIH-1. Nous nous sommes proposés d'étudier le rôle de NF-kappaB sur la transcription du VIH-1 dans les cellules MDMs lors d'une co-infection VHC/VIH-1. Des études préliminaires conduites dans notre laboratoire ont montré que la charge virale VIH-1 était plus élevée dans les cellules PBMC et MDMs provenant de sujets co-infectés que chez les sujets mono-infectés. Nous avons observé, in vitro, que les protéines Nef du VIH-1 et Core du VHC activent le complexe p50/p65 de NF-kappaB dans les cellules MDM. Grâce à une technique reposant sur l'expression de la luciférase, nous avons montré que les deux protéines activaient la transcription du LTR du VIH-1. Nous avons également démontré que les protéines Nef et Core activent la réplication du VIH-1 dans les cellules promonocytaires chroniquement infectés U1. De plus, ces protéines stimulaient également la réplication du VIH-1 dans des macrophages primaires infectés par le virus. Par conséquent, les deux protéines Nef et Core pourraient favoriser la formation de réservoirs cellulaires contenant les deux virus. L'ensemble de ces études nous a permis de mieux comprendre le rôle de NF-kappaB dans la transcription virale au sein des macrophages.