Quantitative metabolism of natural and antiviral nucleosides and nucleotides in human cells by LC-MS/MS

par Emilie Fromentin

Thèse de doctorat en Chimie analytique et pharmacologie

Sous la direction de Raymond F. Schinazi.

Soutenue en 2010

à l'AgroParisTech .

  • Titre traduit

    Etude quantitative du métabolisme de nucléosides antirétroviraux dans des cellules humaines par LC-MS/MS


  • Résumé

    Notre laboratoire, Laboratory of Biochemical Pharmacology (LOBP), dirigé par Dr R. F. Schinazi, est spécialisé dans la recherche sur les nucléosides analogues et plus particulièrement les inhibiteurs de la transcriptase inverse. Au sein de ce laboratoire, l'équipe de pharmacologie a pour rôle d'étudier le métabolisme des molécules en développement ainsi que des molécules déjà commercialisées dans des cellules humaines en culture. Les résultats obtenus guident les chimistes vers une synthèse de composés plus actif et moins toxiques. Pour les molécules les plus avancées, comme l'amdoxovir TM , les études réalisées au laboratoire relèvent du stade II d'essai clinique. Le rôle de l'équipe analytique est de réaliser toutes les mesures liées aux essais cliniques et cellulaires. Pour cela, nous avons choisi d'utiliser des instruments permettant des mesures spécifiques avec une sensibilité suffisante pour mesurer des quantités de l'ordre du ppb. Notre choix s'est donc porté sur la chromatographie haute performance en phase liquide couplée à un spectromètre de masse de type triple quadrupôle. Puisque seuls les métabolites phosphorylés des nucléosides analogues sont actifs dans les cellules, il fut nécessaire de développer une méthode pour analyser ces composés polaires. Cette méthode, présentée dans le premier chapitre, permet l'analyse simultanée de la plupart des métabolites de nucléosides analogues commercialisés, ceux de l'amdoxovir et des nucléotides naturels présents dans les cellules. Les limites de détections sont telles que de très faibles niveaux de triphosphates ont pu être quantifiés dans les macrophages. Ces résultats sont présentés à la fin du second chapitre. Dans le deuxième chapitre, nous avons voulu approfondir nos connaissances sur le métabolisme de l'amdoxovir dans les lymphocytes. Pour cela, nous avons testé l'amdoxovir en présence de nucléosides susceptible d'inhiber sa phosphorylation. Puis nous avons établit l'absence d'interaction directe entre l'amdoxovir et trois autres nucléosides analogues commercialisés. Finalement, des études plus poussées sur les nucléotides naturels donnent une indication pour expliquer les effets synergiques entre l'amdoxovir et la zidovudine. Dans le dernier chapitre, nous présentons le développement et la validation d'une méthodologie permettant de mesurer simultanément les niveaux d'amdoxovir, de son métabolite principal et de la zidovudine dans des échantillons de plasma humain. Cette méthode a été appliquée à une étude clinique dont les résultats sont brièvement décrits.


  • Résumé

    Our laboratory is specialized in drug discovery and development, more specifically in nucleoside analogue research as potential antiviral agents. The laboratory is organized in several teams, including, chemists, virologists, molecular biologists and pharmacologists. The pharmacologists study the metabolism of both FDA approved and new drugs in vitro and in humans. Amdoxovir TM is in development in our laboratory as anti-human immunodeficiency virus (HIV) and is in phase I/II clinical trial. The analytical team studies antiviral agents from cell culture work to clinical trials. To accomplish this goal, we used high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, which is sensitive and specific enough to detect analytes in the ppb range, in a complex biological matrix. Since only the triphosphate forms of the nucleoside analogues are active intracellularly, it was necessary to develop a method to analyze these polar compounds. The method, presented in the first chapter, was successfully used for the simultaneous quantification of the nucleotide (phosphate forms) metabolites of approved nucleoside, amdoxovir as well as for endogenous natural nucleotides in human lymphocytes and macrophages. The limits of quantification were low enough to measure nucleotide levels in the ppb range. In the second chapter, we extended our knowledge on amdoxovir metabolism in primary human lymphocytes cells. To do so, we incubated amdoxovir with nucleosides susceptible of inhibiting its phosphorylation. Then, we established the lack of interaction between amdoxovir and three other nucleosides analogues. Finally, deeper studies on endogenous natural nucleotides provided an understanding of the antiviral synergistic effects between amdoxovir and zidovudine that was demonstrated in vitro and in humans. The development and validation of a methodology to quantify amdoxovir, its metabolite and the approved drug zidovudine in plasma is presented in the first chapter. This method was applied to a proof-of-concept study conducted in 24 HIV-infected individuals.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (151 p.)
  • Annexes : Bibliographie 248 réf., p.

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