Rôle de ß-défensines aviaires dans la résistance du poulet à l'infection intestinale à Salmonella Enteritidis

par Chrystelle Derache

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé, spécialité Infectiologie et vaccinologie

Sous la direction de Anne-Christine Lalmanach et de Thierry Magallon.

Soutenue le 12-06-2009

à Tours , dans le cadre de Ecole doctorale Santé, sciences, technologies (Tours) , en partenariat avec SST/INRA-UR918 - Unité de rech. de pathologie infectieuse et immunologie (équipe de recherche) .

Le président du jury était Isabelle Dimier-Poisson.

Le jury était composé de Philippe Bulet, Joel Pestel, Richard Ducatelle.


  • Résumé

    Les entérobactéries du genre Salmonella représentent une préoccupation majeure de santé publique car elles sont responsables de la majorité des cas de toxi-infections alimentaires dans le monde. La persistance de Salmonella Enteritidis dans les élevages de volailles, sous forme de portage bactérien intestinal, constitue une source de contamination importante pour les produits alimentaires qui en sont issus. Parmi, les nombreuses solutions mises en place, l’amélioration de l’immunité de la muqueuse digestive des oiseaux faisant barrière à la colonisation bactérienne représente une stratégie de lutte alternative à l’utilisation controversée des antibiotiques. Au cours de la réponse de l’hôte contre l’infection des salmonelles, il avait été montré que les gènes de ß-défensines aviaires, AvBD1 et AvBD2, sont fortement exprimés dans l’intestin des poulets résistants à la colonisation bactérienne. Les ß-défensines sont des peptides cationiques capables de détruire les bactéries mais aussi, chez les mammifères, d’attirer les cellules immunitaires. Dans ce contexte, la compréhension du mode d’action des deux ß-défensines aviaires contre l’infection intestinale des poulets par les salmonelles a constitué l’objectif principal du travail de thèse. Tandis que les AvBD1 et AvBD2 ont été initialement identifiées à partir de cellules hétérophiles, nous avons cherché à savoir si les cellules épithéliales intestinales, constituant la première barrière rencontrée par les bactéries, pouvaient les exprimer. Une procédure de culture primaire de cellules épithéliales intestinales isolées d’embryons d’oiseaux a été développée. Les cellules ont montré les caractéristiques de cellules épithéliales confirmées par l’expression de protéines du cytosquelette. Elles ont été capables d’exprimer les gènes d’AvBD1 et d’AvBD2, avec des taux différents selon la lignée d’animaux dont elles sont issues. De plus, cette expression s’est avérée modulable par les salmonelles qui sont capables d’inhiber l’expression d’AvBD2 dans les cellules épithéliales intestinales de la lignée la plus sensible. En parallèle, nous avons extrait trois ß-défensines aviaires de la moelle osseuse, AvBD1, AvBD2 et AvBD7, afin d’évaluer leur activité antimicrobienne. La séquence primaire de ces trois ß-défensines caractérisée par spectrométrie de masse a permis de mettre en évidence des modifications post-traductionnelles dans la partie C-terminale d’AvBD1 et dans la partie N-terminale d’AvBD7. L’activité antimicrobienne mesurée avec les trois ß-défensines a révélé des activités élevées contre des bactéries Gram + et Gram -, avec cependant une moindre efficacité d’AvBD2 contre les bactéries Gram -. La spécififcité d’AvBD2 contre les Gram + est retrouvée chez la ß-défensine du manchot empereur, AvBD103b de structure tridimensionnelle connue. Nous avons alors cherché à résoudre la structure de la ß-défensine 2 de poulet par résonance magnétique nucléaire afin d’analyser les relations entre la structure et l’activité des peptides AvBD2 et AvBD103b. La comparaison de leurs structures nous a permis de proposer un mode d’action de ces deux ß-défensines et plus particulièrement d’AvBD2. Finalement, l’ensemble des résultats obtenus permet de préciser le rôle des ß-défensines aviaires dans le phénotype de résistance/sensibilité à l’invasion intestinale des salmonelles. Outre leur effet antibactérien qui peut être contrecarré par les salmonelles, il semblerait que ces défensines aviaires puissent participer à d’autres fonctions comme le chimiotactisme permettant le recrutement de cellules immunocompétentes. Le spectre d’activité antibactérienne des ß-défensines aviaires caractérisées ouvre de plus des perspectives d’application thérapeutique dans un domaine où les antibiotiques sont plus que sujets à caution.

  • Titre traduit

    Role of avian beta-defensins in chicken resistance to intestinal salmonella enteridis infection


  • Résumé

    Salmonella is a bacterial enteropathogen representing the main cause of food poisoning worldwide. Persistence of Salmonella Enteritidis in poultry flocks in the form of intestinal carriage represents an important source of contamination of poultry derived food products. Improving immunity of the mucosal barrier of the bird intestine to fight bacterial colonisation is a strategy alternative to the controversial use of antibiotics. During the study of chicken response to Salmonella infection, it had been shown that avian ß-defensin genes (AvBD1 and 2) were highly expressed in intestinal tissue of birds resistant to Salmonella colonisation. ß-defensins are cationic peptides able to kill bacteria and also, in mammalian species, to attract cells of the animal immune defence. In this context, understanding the mechanism of action of these two avian ß-defensins against intestinal infection of birds by Salmonella represented the main objective of the thesis work. While AvBD1 and 2 were initially identified from heterophils, we were interested in determining whether the intestinal epithelial cells, which constitute the first barrier encountered by the bacteria, were able to express them. A primary culture of intestinal epithelial cells has been developed from chicken embryos of divergent inbred lines either resistant or susceptible to Salmonella intestinal carriage. The cells exhibited characteristics of epithelial type according to morphology and expression of specific cytoskeletal proteins. They were shown to express the two ß-defensin genes AvBD1 and AvBD2 according to the chicken line. Furthermore, S. Enteritidis interfered with AvBD2 expression only in the cells from the susceptible line. In parallel, we were interested in preparing these ß-defensins in order to assess their antibacterial activity. Chicken bone marrow was used to isolate ß-defensins by acetic acid extraction followed by chromatographic separation. Three purified ß-defensins, AvBD1, AvBD2 and AvBD7 were characterized by mass spectrometry, revealing post-translational modifications in AvBD1 C-terminal end and AvBD7 N-terminal end. Antimicrobial activity measured by radial diffusion assay has shown a high efficiency against Gram + and Gram – except for AvBD2 with a lower potency against Gram – bacteria. Antibacterial spectrum of AvBD2 showed specificity towards Gram + bacteria as well as the king penguin AvBD103b whose three-dimensional structure has been described. This prompted us to resolve the structure of AvBD2 by nuclear magnetic resonance in order to analyze structure-activity relationships by comparing these two avian ß-defensins. This approach has led us to propose a mechanism of action for these two ß-defensins and particularly for AvBD2 in the intestinal mucosa. Finally, taken together the results allow to further define the role of avian ß-defensins in the phenotype of resistance/susceptibility to intestinal invasion by Salmonella. In addition to their antibacterial activity, which can be overcome to some extend by Salmonella, they could display other functions such as chemotaxis allowing recruitment of immune competent cells. The characterization of the activity spectrum of these avian ß-defensins opens perspectives of therapeutic application in a domain where antibiotics use should be avoided.

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