Sélection d'aminopeptidases de Streptomyces griseus par des gouttelettes microfluidiques

Selection of streptomyces griseus aminopeptidases by droplet microfluidics

• Auteur / Autrice : Dave van Ditmarsch
• Direction : Andrew D. Griffiths
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Strasbourg

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microfluidique

Streptomyces griseoviridis

Aminopeptidases

Résumé

L’aminopeptidase de streptomyces griseus (SGAP; numéro de l’enzyme commission 3. 4. 11. 10) peut catalyser plusieurs réactions: elle est (i) une aminopeptidase non-spécifique, (ii) une diesterase de phosphate et (iii) une oxidase de catéchol. Supposée d’être un intermédiaire évolutif, elle peut être utilisée pour caractériser des voies d’évolution. Le tri activé par la fluorescence des gouttelettes (FADS) pourrait être utilisé comme outil pour faire de l’évolution dirigée de la SGAP. Ce projet décrit le développement d’un système d’expression bactérien pour la SGAP, d’un test fluorogénique pour l’activité peptidase de la SGAP ainsi que son utilisation dans une sélection microfluidique. Le facteur d’enrichissement expérimental (28. 9) est proche du maximum théorique (110. 5). Ensuite, la sgap a été fusionnée avec mcherry---une protéine fluorescente dans les longueurs d’onde rouge---afin de normaliser pour le niveau d’expression de la SGAP. Une correlation de R2 = 1. 00 a été trouvée entre l’activité de la SGAP et la fluorescence de mcherry. Mais il n’était pas possible de détecter la mcherry en microfluidique dû au montage optique. Pour caractériser des voies d’évolution, il faut pouvoir trier pour deux activités simultanément. à cet effet l’acide 7-aminocoumarine-4-méthanesulfonique a été synthétisée comme composante des nouveaux substrats fluorogéniques. Enfin, comme projet parallèle, de la transcription et traduction in vitro de lacz dans des émulsions 2d a démontré que le mélange de l’huile et du tensioactif utilisé était biocompatible. En plus, il était possible de détecter la lacz à une telle faible concentration, que les analyses (méta-)génomiques sont envisageables.

Streptomyces griseus aminopeptidase (SGAP; Enzyme Commission number 3. 4. 11. 10) is capable of catalyzing multiple reactions: it is (i) an aminopeptidase with a broad substrate specificity, (ii) a phosphodiesterase and (iii) a catechol oxidase. Being considered an evolutionary intermediate, it is a good model for answering outstanding questions in evolutionary biology. Fluorescence-activated droplet sorting (FADS) could be used to evolve this enzyme by directed evolution. This project describes the development of a bacterial expression system for SGAP, a fluorescence-based SGAP peptidase assay and the use of this assay to perform a microfluidic activity-based selection of SGAP. The experimental enrichment factor (28. 9) approached the theoretical maximum (110. 5). Next, SGAP was fused to mCherry---a red fluorescent protein---to normalize for sgap expression level. SGAP peptidase activity and mcherry fluorescence correlated with an R2 of 1. 00. It did not prove possible to detect the mCherry fluorescence in droplets due to nature of the optical setups. Many of the unanswered questions in enzyme evolution require the simultaneous selection of two activities. So, 7-aminocoumarin-4-methanesulfonic acid (ACMS) was synthesized, as a building block for new fluorogenic peptidase substrates. Finally, as a side-project, work done on 2D emulsions using in vitro transcription and translation of lacZ demonstrated that the surfactant/oil mixture used in 2D emulsions was biocompatible. Additionally, it proved possible to detect lacZ at very low concentrations, permitting genomic or metagenomic analyses to be performed.