Droplet-based microfluidics and engineering of tissue plasminogen activator for biomedical applications

par Lucia Granieri

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Andrew Griffiths.

Soutenue en 2009

à Strasbourg .

  • Titre traduit

    Technologie des microgouttelettes dans les systèmes microfluidiques et ingénierie de l’activateur plasminogène tissulaire pour des applications biomédicales


  • Résumé

    Le phage display est une méthode généralement utilisée pour l'évolution dirigée de protéines, elle permet de produire une immense diversité de variants de protéines exprimés sur la membrane de particules virales. Ces variants de protéines peuvent être sélectionnés soit pour leur affinité de liaison (p. Ex. Les anticorps) soit pour leur activité catalytique (p. Ex. Les enzymes). La sélection d'enzymes pour leur activité catalytique requiert néanmoins l'utilisation de substrats et/ou produits immobilisés, ce qui empêche la sélection de protéines sur plusieurs cycles catalytiques. Le but de ce projet de thèse était de développer une méthode nous permettant d'outrepasser ces limites : la compartimentation dans des systèmes microfluidiques de particules virales exprimant des variants de protéines unique sur leur surface. L'encapsulation de ces particules dans des gouttes nous a permit d'utiliser des substrats/produits solubles et donc la sélection pour de multiples cycles catalytiques a été possible. L'utilisation d'un système d'expression mammifère a permit aux protéines de subir les modifications post-traductionnelles (ponts disulfure, glycosylations) nécessaires. Ce système permet de monitorer l'activité enzymatique, de variants de protéines uniques d'une banque, exprimés sur la membrane de particules virales. En plus, nous avons développé un système nous permettant de trier des virus en utilisant comme critère la présence ou l'absence d'activité enzymatique.


  • Résumé

    Phage display is a widely used method for directed evolution of proteins, allowing the generation of an enormous diversity of protein variants displayed on the viral particles (library diversity <1012). These protein variants can then either be selected for binding affinity (e. G. Antibodies) or for catalytic activity (e. G. Enzymes). However, since selection for catalytic activity requires immobilized substrates and/or products, selection for multiple turnover or maximum rate acceleration remains challenging. To overcome these limitations a new method has been developed: Microfluidic-based compartmentalisation of viral particles displaying single protein variants on their surface. Encapsulation of these particles into picoliter drops allows the use of soluble substrates/products and therefore the selection for multiple turnover. The model system used here is based on retroviral particles displaying tPA (tissue plasminogen activator), a protein used in current emergency therapies of myocardial infarction and stroke, and a non-related control protein (neuraminidase, NA, inactive particles). Single particles displaying tPA and NA variants were encapsulated into aqueous droplets and the enzymatic activity was monitored using a fluorescence assay. Active variants could be sorted from a mixture of active and inactive variants.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (IX-117 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f. 102-117

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  • Bibliothèque : Université de Strasbourg. Service des bibliothèques. Bibliothèque L'Alinéa.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : Th.Strbg.Sc.2009;0348
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