Expressao da glicoproteina recombinante do virus rabico em sistemas Drosophila melanogaster (S2) e Semliki Forest Virus (SFV)

par Renato Mancini Astray

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologieAspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Franc Pattus et de Carlos Augusto Pereira.

Soutenue en 2009

à Strasbourg en cotutelle avec Sao Paulo - Brésil .

  • Titre traduit

    L' expression de la glycoprotéine du virus de la rage dans les systèmes Drosophila melanogaster (S2) et Semliki Forest Virus (SFV)


  • Résumé

    La glycoprotéine du virus de la rage (RVGP) doit adopter une forme oligomérique et exige des modifications post-traductionnelles afin de présenter sa conformation antigénique correcte et exprimer sa fonction biologique. L’utilisation de cellules eucaryotes supérieures comme hôte d'expression est donc recommandée. Nous avons étudié les cinétiques d’expression de la RVPG et de son ARN messager (RVGPARNm) dans les cellules S2 de D. Melanogaster transfectées de manière stable (rS2) et dans les cellules BHK-21 infectées par un Semliki Forest Virus recombinant (SFV-RVGP). Pour ce faire, nous avons utilisé un ELISA pour le dosage de la RVPG et une RT-PCR quantitative (qRT-PCR) pour le dosage de RVGPARNm. Nous avons démontré que la concentration maximale de RVGPARNm sous contrôle d’un promoteur constitutif (actine) dans les cellules rS2 a été coïncidant avec la concentration maximale de protéine RVGP par cellule. Quand l’expression du RVGPARNm est contrôlée par un promoteur inductible (metallotionein), la concentration maximale est atteinte 48 heures après l’induction et la production de RVGP est elevé. Dans les cellules BHK-21 infectées par le SFV-RVGP nous avons observé une correspondance directe entre taux d’infection (ROI) utilisée et les concentrations de RVGPARNm et RVPG. Pour le calcul des ROI, nous avons mis au point une méthode de titration des particules SFV par qRT-PCR, qui peut être appliquée à d’autres constructions de SFV recombinant. Dans des essais préliminaires d’immunisation de souris, les préparations de RVPG utilisées ont induit la formation d’anticorps neutralisants et ont donné une bonne protection contre une infection expérimentale par le virus de la rage.

  • Titre traduit

    Rabies virus glycoprotein expression in Drosophila melanogaster (S2) and Semliki Forest Virus (SFV) systems


  • Résumé

    The rabies virus glycoprotein (RVGP) has to be oligomerized and undergo post-translational modifications in order to show its antigenic conformation and biologic function. Therefore, the recombinant RVGP expression in higher eukaryotic cells is mandatory. We have studied the kinetic expression of RVGP and its messenger RNA (RVGPmRNA) in stably transfected D. Melanogaster cells (rS2) and BHK-21 cells infected with a recombinant Semliki Forest Virus (SFV-RVGP). For this purpose RVGP was quantified by ELISA and RVGPmRNA by quantitative RT-PCR (qRT-PCR). In rS2 cells, we demonstrated that the RVGPmRNA regulated by a constitutive promoter (actin) presented a concentration peak coincident with the highest concentration of RVGP/cell. When the RVGPmRNA expression was regulated by an inducible promoter (metallotionein), its level was maximum 48 h after induction and the RVGP production was high. In the expression using BHK-21 cells infected with SFV-RVGP we observed a direct correspondence, between the ratio of infection (ROI) and the amount of RVGPmRNA and RVGP produced. For the calculations of the ROI used, we have developed a new method of SFV particles titration by qRT-PCR, which we have shown to be applicable to other recombinant SFV constructions. The samples of RVGP used in preliminary experimental mouse immunization assays were able to induce neutralizing antibodies and to lead to protection against the experimental intracerabral rabies virus challenge.

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  • Détails : 1 vol. (Pagination multiple)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f. 123-134

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  • Disponible pour le PEB
  • Cote : Th.Strbg.Sc.2009;0197
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  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : MFTH 9182

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  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : 2009STRA6127
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