Contribution à l'étude de l'apoptose endothéliale cornéenne humaine

par Souad Herrag

Thèse de doctorat en Ingénierie médicale et biologique

Sous la direction de Philippe Gain.


  • Résumé

    La perte de cellules endothéliales cornéennes (CEC) observée lors de la conservation des greffons cornéens est principalement due au déclenchement d’un phénomène apoptotique. Nous avons, dans un premier travail, établi un modèle in vitro d'apoptose des CEC dans laquelle la staurosporine (STS) déclenche une activation de la caspase-3. L'activation des caspases, une famille d’enzymes capables de cliver des protéines structurales et fonctionnelles vitales, est une étape précoce et décisive du déroulement de l'apoptose dans de nombreux types cellulaires. Dans un second travail, nous avons déterminé l'efficacité de Boc-D-fmk, un inhibiteur de caspases irréversible et à large spectre, à inhiber l'apoptose des CEC humaines induite par la STS. Les CEC humaines ont été étudiées après 3, 6, 12, 18 et 24 heures d'incubation avec 0,2 μM de STS en absence ou en présence de Boc-D-fmk 50 μM, précédé d'un prétraitement d'1 heure avec BOC seul. Des cultures non traitées servaient de témoins. La desquamation cellulaire a été quantifiée. Les extraits cellulaires ont été analysés par fluorimétrie en microplaque afin de déterminer l'activité protéolytique des caspases en utilisant cinq substrats fluorogéniques clivés préférentiellement par les caspase-2 (Ac-Z-VDVAD-AFC), caspase-3 (DEVD-AMC), caspase-6 (VEID-AMC), caspase-8 (Z-IETD-AFC) et caspase-9 (Ac-LEHD-AFC). Un double marquage de l’ADN (Hoechst 33342/iodure de propidium) a permis de visualiser la fragmentation nucléaire. La viabilité cellulaire a été évaluée par la mesure de l'activité mitochondriale lors d'un test au MTT. La viabilité après 24, 48 et 72 de remise en conditions normales (sans STS ni inhibiteur) a été également évaluée. La STS était capable d'activer les 5 caspases avec un pic à 12 heures comme nous l'avions précédemment décrit pour la caspase-3. L'activité des caspases-2, -3, et -9 était totalement bloquée par Boc-Dfmk. Les activités des caspases-6 et -8 étaient réduites de 90 %. La desquamation cellulaire et la fragmentation de l’ADN étaient totalement inhibées tant que l'inhibiteur était présent. De plus, la viabilité cellulaire en présence d'inhibiteur+STS était similaire à celle du contrôle non exposé à la STS. Après 48 heures de remise en condition standard, une mortalité cellulaire était cependant observée, probablement due à une induction trop massive par la STS. L'effet de l'inhibition des caspases au cours de la conservation des greffons cornéens en organoculture nous semble constituer une piste à explorer pour améliorer la qualité des greffons en organoculture.


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Informations

  • Détails : 1 volume (119 f.)
  • Notes : publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. 455 ref.

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  • Bibliothèque : Université Jean Monnet. Service commun de la documentation. Section Santé.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : EMT 17
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