Stratégies anti-apoptotiques dans les structures corticales au cours du développement : apport des siARNs dans les greffes neuronales et dans l’excitotoxicité

par Arnaud Desfeux

Thèse de doctorat en Sciences de biologie cellulaire. Neurosciences

Sous la direction de Bruno Gonzalez.

Soutenue en 2009

à Rouen .


  • Résumé

    L’apoptose est un type de mort cellulaire programmée qui joue un rôle crucial dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques du système nerveux central tels que le neurodéveloppement et les maladies neurodégénératives. Les voies apoptotiques sont multiples mais extrêmement bien conservées entre les différents types cellulaires et les différentes espèces animales. En particulier, plusieurs voies apoptotiques sont dépendantes des protéines de la famille BCL-2. La transplantation de précurseurs neuronaux dans le système nerveux central pourrait représenter un outil thérapeutique puissant contre les maladies neurodégénératives. Toutefois, de nombreuses cellules dégénèrent rapidement après la transplantation via une mort cellulaire programmée dépendante des caspases. Ce travail de thèse repose sur l’hypothèse selon laquelle la caractérisation des voies apoptotiques associées à la dégénérescence d’un précurseur neuronal donné va permettre le développement d’outils moléculaires permettant de contrôler sa survie. En particulier, le blocage transitoire de l’apoptose par la stratégie ARN interférence pourrait accroître la viabilité de greffes de précurseurs neuronaux et favoriser ainsi leur intégration fonctionnelle. L’objectif de cette thèse a consisté à tester cette hypothèse dans deux modèles de cortex immature : le cortex cérébelleux et le cortex cérébral. Sur la base de travaux précédents, de nombreuses données suggèrent que la voie mitochondriale joue un rôle clé dans l’apoptose des précurseurs des neurones en grain du cortex cérébelleux. L’objectif de la première étude a consisté à déterminer si la répression du gène pro-apoptotique BAX i) suffisait à bloquer la dégénérescence de ces précurseurs et ii), pouvait améliorer la survie de neurones en grain immatures transplantés dans le cortex cérébelleux de jeunes rats. Dans un premier temps, des expériences menées in vivo et ex vivo ont révélé que le C2-céramide, un inducteur d’apoptose, augmente l’expression de BAX dans les neurones en grain immatures. La transfection de ces précurseurs par des siARNs dirigés contre BAX réduit le clivage de la caspase-3 et augmente significativement leur survie dans les premières 24 heures. Dans un deuxième temps, des neurones en grain immatures préalablement marqués au BrdU ont été transplantés dans le cervelet immature. Vingt-quatre heures après l’allogreffe, les précurseurs transfectés par les siARNs dirigés contre BAX se caractérisent par une réduction significative de la caspase-3 clivée et certains d’entre eux présentent de courts prolongements. Comparé aux précurseurs transfectés à vide, le volume du greffon est deux fois plus important. Ces résultats mettent en évidence un rôle important de la protéine BAX dans la survie de précurseurs neuronaux transplantés. Dans la suite de ce travail de thèse, nous avons voulu déterminer si le blocage de l’apoptose par la stratégie siARN in vivo pouvait être appliqué à un contexte lésionnel. Compte tenu des thématiques étudiées au laboratoire, nous nous sommes intéressés à l’excitotoxicité dans le néocortex immature de souris qui mime certains aspects des lésions cérébrales du nouveau-né. L’hypoxie-ischémie constitue une sérieuse complication chez les prématurés et les nouveau-nés qui peut conduire à des dommages de la substance blanche et du cortex. De nombreux rapports indiquent que la libération massive de glutamate est un processus majeur conduisant à la mort cellulaire. En raison de sa haute perméabilité au calcium, le récepteur ionotropique N-méthyl-D-aspartique (NMDA) joue un rôle important dans le développement des lésions excitotoxiques chez les nouveau-nés. Néanmoins, malgré les nombreuses preuves en faveur d'un rôle central du glutamate dans le développement des lésions corticales du nouveau-né, des effets délétères et pro-apoptotiques d’antagonistes NMDA dans le cerveau immature ont également été décrits. Les objectifs de cette seconde étude ont consisté à i) caractériser l’effet pro-apoptotique du MK801, un antagoniste des récepteurs NMDA, sur la mort cellulaire dans un modèle de tranches organotypiques de cortex cérébral de souris nouveau-née et ii) identifier le(s) type(s) cellulaire(s) affecté(s) par le MK801. Nous avons constaté que selon les couches, une même concentration de NMDA exerce à la fois des effets excitotoxiques, mais aussi des effets anti-apoptotiques dans le néocortex immature. Dans la couche VI, l’excitotoxicité du NMDA est associée à un influx massif et soutenu de calcium dans les neurones et à une nécrose. En revanche, dans les couches immatures II-IV, le NMDA est anti-apoptotique et cet effet est associé à une mobilisation transitoire de calcium dans les neurones. A l’inverse, le MK801 est un puissant activateur de la caspase-3 dans les couches immatures II-IV et cette action affecte les interneurones GABAergiques. L’effet apoptotique du MK801 induit l’expression de BAX, l'effondrement du potentiel mitochondrial et l'activation de la caspase-9. In vivo et ex vivo, les siRNAs dirigés contre BAX et un inhibiteur de la caspase-9 abrogent l’apoptose induite par le MK801 et la formation de noyaux pycnotiques. La kétamine, un anesthésique possédant des propriétés antagonistes NMDA, mime les effets apoptotiques du MK801. Ces résultats ont révélé un effet dual du glutamate sur la survie des neurones GABAergiques en fonction de leur degré de maturité. Ils suggèrent également que certains anesthésiques comme la kétamine pourraient induire l'apoptose des neurones GABAergiques immatures. En conclusion, les travaux obtenus dans le cortex cérébelleux immature indiquent que le blocage transitoire de l’apoptose permet de faciliter la survie d’un précurseur neuronal transplanté dans un tissu hôte. Dans un environnement excitotoxique, les résultats obtenus dans le cortex cérébral immature montrent qu’une même concentration de NMDA présente des propriétés différentes selon les couches corticales et que le MK801, un antagoniste NMDA, est un puissant agent pro-apoptotique pour les neurones GABAergiques. Dans la suite de ce projet, nous envisageons de transposer l’approche « siGreffe », mise au point dans le cervelet, au néocortex immature afin d’évaluer le potentiel de cette stratégie sur le devenir des interneurones GABAergiques transplantés dans un contexte lésionnel.

  • Titre traduit

    Anti-apoptotic strategy in cortical structures during development : contribution of siRNAs in transplants and in neuronal excitotoxicity


  • Résumé

    Apoptosis plays a crucial role in a number of physiological and pathological processes taking place in the nervous system, such as neurodevelopment and neurodegenerative diseases. The intracellular pathways of apoptosis are numerous, but they are extremely well conserved among different cell types and animal species. In particular, several apoptotic pathways have been found to be dependent on BCL-2 family proteins. Transplantation of neuronal precursor cells into the central nervous system could represent a powerful therapeutic approach against neurodegenerative diseases. Unfortunately, numerous cells die shortly after transplantation, predominantly due to caspase-dependent apoptosis. In the present PhD thesis, we hypothesized that a precise characterization of the apoptotic mechanisms leading to the death of a neuronal precursor would provide molecular tools to control its life/death decision. In particular, the in vivo siRNA strategy would be useful to transiently repress the expression of apoptotic genes and to favour the transplantation and the functional integration of neuronal precursors. Objectives of this project consisted in testing this hypothesis in two models: the immature cerebellar and cerebral cortices. Based on previous results, the mitochondrial pathway appears to play a key role in apoptosis of immature cerebellar granule cells. In a first study, we researched if BAX repression was sufficient i) to block apoptosis of this type of precursors and ii) to favor the survival of cerebellar precursors transplanted in the immature cerebellar cortex. In a first step, we found that C2-ceramide, a pro-apoptotic factor, was capable to induce BAX expression both in vitro, ex vivo and in vivo. In vitro, tests using cerebellar precursors demonstrated that the Bax-specific small interfering RNA (siRNA) could reduce apoptotic death and caspase-3 cleavage within the first 24 h. In a second step, BrdU-labelled precursors were subjected to transfection procedure with or without siRNA introduction before using for transplantation. Twenty-four hours after, the allografted cells containing siRNA showed significantly reduced level of caspase-3 cleavage and the volume of the implants was almost two fold higher than in the case of empty-transfected precursors. These data evidence an important role of BAX in life/death decision of grafted immature granule cells and suggest that RNA interference strategy may be applicable for maintaining precursor survival within the critical first hours after their transplantation. The continuation of this thesis consisted in determining if the in vivo siRNA strategy would be applied in a pathological context. Based on the thematic of the laboratory, we focused our experiments in the model “excitotoxicity and the developing mice cerebral cortex” which, by some aspects, is representative of brain injuries in human newborns. Hypoxia-ischemia constitutes a serious complication in preterm and newborn infants which can lead to white matter and/or cortical damages. Numerous reports indicated that the massive release of glutamate represents a major process leading to cell death and because of its high permeability towards calcium, the ionotropic N-methyl-D-aspartic acid (NMDA) receptor is thought to play an important role in the development of excitotoxic lesions in neonates. Nevertheless, despite numerous evidences in favour of a pivotal role of glutamate in the development of cortical lesions in newborns, deleterious and pro-apoptotic effects of NMDA antagonists have been also described. The objectives of the second study were i) to characterize the effect of MK801, a NMDA antagonist, on cell death in a model of mice neonate cerebral slices and ii) to identify the cell types affected by MK801. We found that, depending of the layers, a same concentration of NMDA exerts both excitotoxic but also anti-apoptotic effects in the cortex of neonate mice. In layer VI, NMDA excitotoxicity is associated with a sustained calcium mobilization in neurons and necrosis. In contrast, in immature layers II-IV, NMDA is anti-apoptotic and this effect is associated with a transient calcium mobilization in neurons. On the contrary, MK801 is a potent activator of caspase-3 in immature layers II-IV and it affects GABAergic interneurons. Apoptotic action of MK801 induces BAX expression, collapse of the mitochondrial potential and activation of caspase-9. In vivo BAX siRNA and a caspase-9 inhibitor abrogate the MK801-induced apoptosis and the formation of pyknotic nuclei. Ketamine, an anaesthetic with NMDA antagonist properties mimics the apoptotic effects of MK801. These data revealed a dual effect of glutamate on survival of immature and mature GABAergic neurons and suggested that ketamine may induce apoptosis of immature GABAergic neurons. In conclusion, the present results obtained in the immature cerebellar cortex indicate that a blockade of apoptosis by using the siRNA strategy favour the survival of grafted precursors. In an excitotoxic environment, the data obtained in the immature cerebral cortex reveal that a same concentration of NMDA exerts opposite effects on life/death decision depending of the cortical layer considered. In addition, MK801, an NMDA antagonist, is a potent pro-apoptotic factor for GABAergic neurons. In perspectives, we planned to transpose the « siGraft » approach from the cerebellar cortex to the immature cerebral cortex in order to characterize the functional integration of transplanted GABAergic neurons in a lesional context

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Informations

  • Détails : 1 vol. (225 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. 283 ref.. Contient des articles en anglais

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  • Bibliothèque : Université de Rouen. Service commun de la documentation. Section Lettres-Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 09/ROUE/S014
  • Bibliothèque : Université de Rouen. Service commun de la documentation. Section sciences site Madrillet.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : 09/ROUE/S014
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