Étude de l'effet de l'expression de la protéine virale Nef du virus de l'immunodéficience humaine sur la lymphopoïèse T

• Auteur / Autrice : Fanny Brizzi
• Direction : Yves Lévy
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 27/11/2009
• Etablissement(s) : Paris Est
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Créteil ; 2010-2015)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : U841-Equipe 16
• Jury : Président / Présidente : Roger Le Grand
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Yves Lévy, Roger Le Grand, Rémi Cheynier, Stéphane Basmaciogullari
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Rémi Cheynier, Stéphane Basmaciogullari

Mots clés

Mots clés contrôlés

Apoptose

Lymphocytes T

Hématopoïèse

Protéines virales

Mots clés libres

Nef

Lymphopoïèse T

Apoptose

Résumé

La destruction du compartiment T CD4 induite par le VIH‐1 est essentiellement périphérique. Cependant, l’atteinte des précurseurs lymphocytaires T, pour laquelle existent des arguments, est encore mal connue. L’objectif de ce travail a été d’explorer le rôle de la protéine Nef, hors contexte d’infection virale, dans la différenciation lymphoïde. Nef, produite très tôt après l’infection par le VIH‐1, possède un rôle‐clé dans la pathogénie, comme en témoigne la reproduction, chez la souris transgénique pour Nef, d’une maladie proche de la maladie humaine. Dans les lymphocytes matures infectés, Nef module l’expression du récepteur CD4, des molécules du CMH de classe I et induit un état d’activation T. Nef interagit également avec de nombreux partenaires cellulaires impliqués dans des voies de signalisation cytokinique, de contrôle de l’apoptose et de l’ontogénie T. Au cours de ce travail, nous avons montré que l'expression de Nef en absence d'autres gènes viraux bloquait le potentiel T et NK des précurseurs hématopoïétiques humains par un mécanisme apoptotique indépendant des caspases et lié à une perturbation du potentiel mitochondrial. Grâce à l’utilisation du système de culture OP9‐DL1 permettant l’identification des premiers stades de différenciation des cellules T, nous avons montré que la génération de cellules T à partir de CD34+ est affectée à un stade CD3+CD5+CD1a+ qui a initié le réarrangement D‐J du TCRβ. Les stades suivant du développement T sont aussi affectés, en effet, une réduction quantitative du nombre de CD4 ISP et de DP CD4+CD8+ TCRαβ a été observée. Nef diminue aussi la génération de cellules NK CD56+ alors que la production de cellules B n’est pas affectée. Des analyses par dilution limite montrent une réduction significative de la fréquence des précurseurs T/NK parmi les cellules CD34+ exprimant Nef. Nous avons par ailleurs montré une augmentation de 15 à 25% de cellules apoptotiques dans les cellules exprimant Nef‐WT par rapport aux autres conditions. Cette apoptose n’est pas caspase dépendante et La voie Fas/Fas‐L ne semble pas entrer non plus en jeu. Nous avons par ailleurs pu déterminer que l’atteinte apoptotique des précurseurs passait par une déstabilisation mitochondriale, ceci grâce à un marquage DIOC6. L’ensemble des résultats regroupés dans de ce travail permet d’approfondir les connaissances des mécanismes d’interférence du VIH avec l’hématopoïèse et plus précisément des actions de Nef sur l’hématopoïèse humaine.

HIV-1 infection is characterized by a progressive loss of CD4 T cell leading to a severe immune deficiency. More than 20 years after the identification of HIV, the exact mechanisms by which HIV leads to the depletion of CD4 T cells are not completely understood and remain a matter of cntroversy. The purpose of this work has been to explore out of the viral context, the effect of the HIV-1 Nef protein on the T cell differentiation. The HIV-1Nef gene is essential for AIDS pathogenesis. HIV-1Nef protein is a 27‐kDa protein that is expressed early during cell infection. Nef increases viral replication in vivo and enhances viral infectivity. Nef interferes with the expression of crucial molecules at the surface of lymphocytes such as CD4, MHC class I and II, CD28, DC‐SIGN, and chemokine receptors. Nef also alters T-cell signaling pathways and immunological synapse formation. During this work, we found that Nef expression in hematopoietic precursors interfere by an apoptotic pathway in the differentiation of a T/NK progenitor. In order to study the differenciation, we used a recent model of murine stromal cells engineered to express the Notch ligand delta 1 (OP9‐DL1 system). This system allows the differentiation of hematopoietic progenitors to a DP CD4+CD8+ stage and led us to examine the effects of Nef expression on T‐cell development. For this, Nef was expressed in hematopoietic CD34+ precursors using lentiviral vectors. In this study, we demonstrate that HIV-1Nef expression in the absence of other viral genes hampers the T and NK cell potential of human hematopoietic progenitors. We show that the generation of T cells from CD34+ progenitors is affected at a CD3ε+CD5+CD1a+ precursor stage that has initiated a DJB rearrangement of the TCRB locus. Subsequent stages of T cell development were also affected with a quantitative reduction of CD4 ISP and DP CD4+CD8+ TCRαβ cells. Nef also decreased the generation of CD56+NK cells whereas B cell production was not affected. Limiting dilution analyses demonstrated a significant reduction in the frequency of T/NK progenitors among Nef‐expressing CD34+ cells. Collectively, these data indicate that Nef interferes with the differentiation of a primitive lymphoid precursor with a T/NK potential. This interference was caused by the triggering of an apoptotic pathway which triggered the mitochondrial depolarization. This study allows a better knowledge of the interference mechanisms used by HIV on the T cell hematopoïesis, more accurately on the effect of Nef on human T cell differentiation