Amélioration de la secrétion hétérologue chez lactococcus lactis

par Nicolas Tremillon

Thèse de doctorat en Sciences biologiques. Microbiologie

Sous la direction de Isabelle Poquet.


  • Résumé

    La bactérie lactique Lactococcus lactis est un hôte intéressant pour produire, sécréter et purifier des protéines hétérologues. L’INRA a construit un système d’expression et une souche hôte mutée dans l'unique protéase extracellulaire HtrA et où les protéines exportées sont stables, d’où un meilleur rendement et un avantage concurrentiel. Le système de production INRA est développé en partenariat avec GTP Technology dans le cadre de ma thèse CIFRE. Pour améliorer la souche hôte, j’ai recherché des leviers susceptibles de compenser les fonctions de HtrA, résistance au stress thermique et contrôle qualité des protéines exportées. J’ai sélectionné un suppresseur en multicopie de la thermo-sensibilité du mutant htrA : de fonction inconnue, son effet sur la production de protéines doit être testé. J’ai aussi caractérisé un facteur de repliement de surface, une PPIase, qui n’a pas d’effet sur les protéines testées, et qui aurait un rôle de ménage constitutif. Enfin, j’ai étudié une protéine induite dans le mutant htrA en conditions normales: c’est une protéine de stress de paroi, induite dans la souche sauvage par des antibiotiques qui ciblent la biosynthèse du peptidoglycane, et essentielle à la survie à la bacitracine. Ainsi, l’absence de HtrA perturbe non seulement les protéines d’enveloppe mais aussi la paroi. L’étude de cette nouvelle fonction de HtrA et du rôle de la protéine induite dans la survie va être poursuivie. Parallèlement, j’ai aussi développé l’utilisation du système INRA chez GTP-Technology. J’ai mis au point la production d’une nucléase utile en biologie moléculaire pour clarifier des extraits bactériens, avec un rendement de 200mg/L en mini-fermenteurs.

  • Titre traduit

    Research of new positive factors for heterologous secretion in lactococcus lactis


  • Résumé

    The lactic acid bacterium Lactococcus lactis is an interesting host to produce, secrete and purify heterologous proteins. INRA built up an expression system and a host strain inactivated for the unique extracellular HtrA protease and in which exported proteins are stable, leading to a better yield and a competitive advantage. INRA system development in partnership with GTP Technology is the objective of my PhD thesis (CIFRE fellowship). To improve the host strain, positive factors able to compensate for HtrA functions: heat shock resistance and the quality control of exported proteins, were looked for. A multicopy suppressor of htrA mutant thermosensitivity was selected: its function is unknown and its effect on heterologous protein production has to be tested. An exported folding factor, a PPIase, was also caracterized, but it had no effect on the proteins that have been tested, suggesting a constitutive housekeeping function. At last, a protein induced in htrA mutant under normal conditions was studied. It is a cell wall stress protein, both induced in the wild type strain by several antibiotics targeting peptidoglycan biosynthesis and essential for cell viability when cells are exposed to bacitracin. Thus, the absence of HtrA not only disturbs envelope proteins, but also the cell wall. This new HtrA function and of the role of the induced protein on cell survival will be further studied. In parallel, the use of the INRA expression system at GTP Technology was also developed. The conditions for the production of a nuclease useful in molecular biology to clarify cell extracts were optimised, and a protein yield of about 200mg/L in mini-fermentors could be reached.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (IV-191 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 170-191

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 0g ORSAY(2009)315
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