Incorporation et réparation des uraciles dans l’ADN chez la plante Arabidopsis thaliana

par Emeline Dubois

Thèse de doctorat en Sciences biologiques. Sciences du végétal

Sous la direction de Marie-Pascale Doutriaux.

Soutenue en 2009

à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des Sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .


  • Résumé

    L’enzyme dUTPase, codée par le gène DUT1, joue un rôle essentiel pour prévenir l’incorporation d’uraciles dans l’ADN. Dans un premier temps, nous avons montré que la protéine Dut1 d’Arabidopsis est l’homologue fonctionnel des protéines Dut1 d’E. Coli et de S. Cerevisiae. Ensuite, nous avons réduit l’activité dUTPase par ARN interférence chez Arabidopsis. Les plantes ARNi/DUT1 sont majoritairement létales en première génération. Nous avons travaillé plus précisément sur deux lignées viables et très sensibles au 5-fluoro-uracile (5-FU, un analogue de l’uracile). Une activité dUTPase résiduelle de 40% a été mesurée dans ces deux lignées. Les uraciles sont réparés dans l’ADN par un mécanisme de réparation par excision de base, dont la première étape est l’excision de l’uracile par une glycosylase spécifique de l’uracile (Ung). Le site abasique est ensuite clivé par une endonucléase, laissant une cassure simple-brin, qui peut soit être réparée, soit devenir une cassure double-brin (CDB). Nous avons étudié une lignée d’insertion dans le gène UNG et vérifié qu’il n’y avait plus d’activité Ung dans les plantes mutantes ung-/-. La construction ARNi/DUT1 a été introduite dans ces plantes. Les plantes ung-/- ARNi/DUT1 sont viables, et moins sensibles au 5-FU, suggérant que la toxicité est en partie due à l’excision des uraciles dans les plantes ARNi/DUT1. Une caractérisation biochimique de la protéine AtUng a également été effectuée, définissant les uraciles dans un contexte simple-brin et double-brin comme substrats. Nous avons ensuite mis en évidence la présence de cassures dans l’ADN des plantes ARNi/DUT1, et détecté une induction de RAD51, codant pour une protéine centrale dans la recombinaison homologue (RH), mécanisme de réparation des CDB. La construction ARNi/DUT1a été introduite dans des lignées portant un substrat pour mesurer les événements de RH, et a permis de mesurer une augmentation d’un facteur 7 de la fréquence de RH par rapport au contrôle. L’incorporation d’uraciles dans l’ADN d’Arabidopsis conduit donc indirectement à la formation de CDB, en partie réparées par la RH.

  • Titre traduit

    Uracil incorporation and repair in DNA of arabidopsis thaliana plants


  • Résumé

    The dUTPase enzyme, encoded by the DUT1 gene, is essential to protect the DNA against uracil incorporation. First, we showed that Dut1 function is conserved between E. Coli, S. Cerevisiae and A. Thaliana. Using a RNAi strategy (interference RNA), we created plant lines with a diminished dUTPase activity compared to the wild-type. We find that the DUT1 gene is probably essential in Arabidopsis with its inactivation conferring frequent lethality. The surviving plants are sensitive to 5-fluorouracil (5-FU). We detect a reduction in dUTPase activity of 60%, compared to the control. Uracils in DNA are repaired by the base excision repair pathway. First, uracils are excised by a glycosylase, Ung, leaving an abasic site. Then, an endonuclease cleaves the abasic site, creating a single-strand break, which can be repaired or transformed in a double-strand break (DSB). We characterize a insertional line in UNG gene, and confirm that, ung-/- mutant plants have no Ung activity. The ung-/- plants crossed with RNAi/DUT1 lines are less sensitive to 5-FU than the RNAi/DUT1 corresponding lines, indicating that uracil excision is one of the reason for 5-FU sensitivity of RNAi/DUT1 plants. We characterized biochemically the AtUng protein. Then, we were able to detect DNA breaks in RNAi/DUT1 plants and an induction of RAD51 in the plants with a decreased dUTPase activity, indicating that DNA damages are induced. Consequently, plants carrying a homologous recombination (HR) substrate transformed with the RNAi/DUT1 construct exhibit an increase of up to seven of HR events. Only the plants that were most sensitive to 5-FU showed an increased HR, thus establishing a link between uracil incorporation and HR.

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  • Détails : 1 vol. (219 f.)

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 0g ORSAY(2009)202
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