Synchrotron Based Fourier Transform Infrared Microspectroscopy and Fluorescence Microscopy : Application on Photodynamic Treated Cancer Cells

par Sirinart Srichan

Thèse de doctorat en Biophysique moléculaire

Sous la direction de Matthieu Réfregiers et de Paul Dumas.

Soutenue en 2009

à Paris 7 .

  • Titre traduit

    Microspectroscopie infrarouge à transformée de Fourier avec source synchrotron et microscopie de fluorescence : application à la thérapie photodynamique de cellules cancéreuses


  • Résumé

    Lors de ce travail nous avons étudié l'effet photodynamique (PDT) de l'Hypocrelline A (HA) sur quatre lignées de cellules cancéreuses (HeLa, Calu-1, K562, K562 RSTI571) par une approche biophysique. Nous avons combiné les informations obtenues par microscopie de fluorescence confocale, tests de cytotoxicité et microspectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (IRTF) pour éclairer la physico-chimie de la PDT. La très haute sensibilité de la microscopie de fluorescence confocale permet de détecter la fluorescence intrinsèque de HA à des concentrations de l'ordre du nanomolaire, de suivre sa pénétration dans les cellules et de réaliser des cartes 3D haute résolution montrant sa distribution. La microspectroscopie IRTF est utilisée à fin de détecter des changements de la composition chimique globale de la cellule et les modifications de la structure des principaux composants cellulaires lors du traitement. L'utilisation d'une source synchrotron autorise une résolution subcellulaire qui devrait permettre de discriminer les réactions à l'intérieur des différents compartiments cellulaires tel que le noyau et le cytoplasme. Les tests de cytoxicité et l'utilisation de marqueurs fluorescents ont permis de comparer les effets des traitements croissants sur les différentes lignées cellulaires et d'optimiser les conditions de traitement pour obtenir différents types de mort cellulaire. Nous avons également montré que la combinaison de la microspectroscopie IRTF et de la microscopie de fluorescence sur un même instrument était possible et permettait de mesurer simultanément le spectre IRTF d'une cellule unique et le type de mort cellulaire qu'elle a subi. Les différentes approches utilisées dans ce travail se combinent pour montrer que HA ne pénètre pas dans le noyau mais est localisée dans le cytoplasme et accumulée autour du noyau après 24 heures d'incubation ; que les 4 lignées cellulaires réagissent de façon similaire ; que des modifications de la composition chimique des noyaux des cellules sont détectables par microspectroscopie IRTF mais que les cytoplasmes des cellules adhérentes sont trop minces pour y détecter des altérations sauf dans la région périnucléaire. Même en absence de pénétration de HA dans le noyau, la microspectroscopie IRTF permet de détecter des changements de la structure secondaire des protéines du noyau et des perturbations des membranes du réticulum endoplasmique et de l'appareil de Golgi sous l'action de espèces oxygénées réactives générées par la PDT.


  • Résumé

    In this thesis, we studied the photodynamic effects of Hypocrellin A on four cancer cell lines using fluorescence microscopy, cytotoxicity tests and FT-IR microspectroscopy. As HA is a natural fluorescent substance, we used this intrinsic property to observe its localization in HeLa cells by fluorescence microscopy. The fluorescence images revealed that HA did not penetrated into the nucleus but localized in the cytoplasm and aggregated perinuclearly after 24 hours of incubation. MTT viability assay was performed to evaluate the optimum PDT conditions (HA and light dose) which induced cell death in the four cell lines HeLa, Calu-1, K562, K562 RSTI571. The dark toxicity of HA on ail cell lines is low, but is increasing dose-dependently. The phototoxicity of HA on all cell lines was increasing in both HA dose and light dose dependent manner. The light irradiation alone affected only negligibly the cell survival. HeLa cells are sensitive to HA PDT than Calu-1 cells. We found also that K562 and K562 RSTI are sensitive to HA. Moreover the synergetic effect of HA and Glivec® on K562 RSTI was observed. FT-IR microspectroscopy detected the changes in the secondary structure of proteins exhibiting an increase of beta sheets characteristics frequency affected by ROS generated from PDT. , with a predominant shoulder at around 1630 cm"1 (for the Amide I band) and 1530 cm"1 (for the Amide II band). Moreover, a slight decrease of the lipid intensity was noticed. Coupling fluorescence microscopy and FT-IR microscopy was carried out on the same instrument. Fluorescence microscopy could reveal the modes of cell death while FT-IR microspectroscopy showed effect of HA PDT on the secondary structure of proteins. All approaches carried out in this thesis revealed that even HA did not penetrate in the nucleus but there are changes in secondary structure of proteins in nucleus which can be observed by FT-IR spectromicroscopy.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (156 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : 120 réf.

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université Paris Diderot - Paris 7. Service commun de la documentation. Bibliothèque Universitaire des Grands Moulins.
  • PEB soumis à condition
  • Cote : TS (2009) 181
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