Etude des cytokines exprimées, après stimulation in vitro par amoxicilline, par des lymphocytes T humains sensibilisés

par Georges Khalil

Thèse de doctorat en Génomes et protéines

Sous la direction de Richard Maroun.

Soutenue en 2009

à Paris 7 .


  • Résumé

    Depuis que les firmes pharmaceutiques ont arrêté la production des déterminants pénicilliniques, l'utilisation des tests cutanés comme méthode de diagnostic est devenue moins standardisée. De plus, les tests cutanés peuvent parfois exposer le malade au risque d'une allergie sévère. Les tests de transformation lymphocytaire (TTL) pour le diagnostic d'une allergie aux pénicillines se basent sur l'utilisation des éléments radioactifs et présentent une sensibilité insuffisante. Le but de notre étude est d'établir une méthode de laboratoire fiable pour le diagnostic des allergies aux pénicillines et qui soit simple et sans danger pour le patient. L'étude a inclus 18 sujets allergiques à l'amoxicilline et 11 témoins. Suite à un prélèvement sanguin, les cellules mononucléaires périphériques sanguines (PBMC) sont isolées par la méthode Ficoll-Hypaque. Les cellules ainsi obtenues sont alors stimulées in vitro avec de l'amoxicilline libre à la concentration de Img/ml. La stimulation par la Phytohemaglutinnine A (PHA) est utilisée pour un contrôle ^positif. Les cytokines IL-2, IL-5 et IFN- y, sécrétées dans le surnageant des cultures lymphocytaires, sont dosées par la méthode ELISA. L'expression au niveau de la transcription des gènes de certaines cytokines (IL- 2, 4, 5, 13, TGF-J3, TNF- a et l'INF- y) est étudiée par RT-PCR. La technique ELISPOT est utilisée pour la détection de ITNF- y seulement. Pour toutes les techniques employées, l'étude des cytokines exprimées en réponse à la stimulation est faite aux 2eme et 5eme jours. À ce jour, notre étude contient le plus grand nombre de patients et de sujets contrôles, en comparaison avec d'autres études publiées qui ont utilisé la méthode ELISA pour le diagnostic de l'allergie à la pénicilline. La comparaison entre patients et témoins a porté sur les valeurs A qui représentent la différence des concentrations des cytokines après et avant stimulation par amoxicilline. Les tests statistiques t de Student et de Mann-Whitney Rank sont utilisés. Les méthodes RT-PCR et ELISPOT n'ont pas été concluantes. Par contre, l'étude par ELISA des différentes cytokines dans le surnageant des cultures lymphocytaires est la méthode la plus sensible et la plus spécifique (respectivement 80% et 100%). L'ensemble des résultats montre clairement que le dosage des cytokines par ELISA, après stimulation in vitro de lymphocytes humains sensibilisés, reste un excellent moyen diagnostic sans aucun danger pour le malade. Outre le fait que les kits ELISA sont disponibles sur le marché, cette méthode peut être réalisée dans de nombreux laboratoires sans avoir recours à un équipement très spécialisé.

  • Titre traduit

    Cytokine expression profile of sensitized human T lymphocytes following in vitro stimulation with amoxicillin


  • Résumé

    Since the withdrawal of penicillin determinants from the market, in addition to the hazard of re-exposing the patient to the drug, skin testing for the diagnosis of penicillin allergy has become less accurate and less standardized. The assay currently used, the lymphocyte transformation test (LTT), lacks sufficient sensitivity, and requires the use of radioactive material. The objective of this study was to establish an accessible and reliable method for the safe diagnosis of penicillin allergy. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from 18 patients who were allergic to penicillin and 12 control subjects using the Ficoll-Hypaque method. The isolated, sensitized cells were stimulated in vitro with amoxicillin (1 mg/mL). Stimulation with phytohemagglutinin A (PHA) was used as the positive control. Transcriptional expression of specific cytokines (IL-2, -4, -5 and -13, TGF-p, TNF-a and IFN-y) was assessed by RT-PCR. IFN-c expression was also evaluated by ELISPOT. Secreted levels of IL-2, -5 and IFN- y were measured by ELISA. All of these assays were performed two or five days, post-stimulation. This study of the in vitro diagnosis of penicillin allergy by the measurement of cytokine concentration in the supernatants of sensitized lymphocytes cultures involved the largest number of patients to-date. The A values (difference in cytokine concentration in the supernatants before and after stimulation) were compared between cases and controls using different statistical tests (Student's t test and the Mann-Whitney rank test). Of the various tests performed in this study, measurement of secreted cytokines using ELISA was the most sensitive and specific (80% and 100% respectively). In vitro stimulation of human lymphocytes sensitized to amoxicillin is a safe and useful test for the diagnosis of penicillin allergy if the ELISA is used to measure cytokine expression. The advantages are that it can be performed by many laboratories since kits to determine cytokines are widely available, and it can be done without the need for particularly specialized equipment.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (145 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : 93 Réf.

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  • PEB soumis à condition
  • Cote : TS (2009) 134
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