Modifications oxydatives des protéines au cours du vieillissement : mise en évidence et identification de cibles dans les lymphocytes humains circulants et caractérisation des effets du 4-hydroxy-nonénal sur l'Hsc70 in vitro

par Sylvie Poggioli

Thèse de doctorat en Structure, fonction et ingéniérie des protéines

Sous la direction de Bertrand Friguet.

Soutenue en 2009

à Paris 7 .


  • Résumé

    Le vieillissement est caractérisé par une altération des fonctions physiologiques dont la fonction immunitaire Aussi, nous avons étudié deux modifications oxydatives des protéines liées à l'âge, la glycation des protéines (AGE) et la conjugaison des protéines à des produits de peroxydation lipidique (4-HNE), dans les lymphocytes humains circulants (PBL). Les protéines provenant de donneurs jeunes et âgés ont été analysées par une approche protéomique. Après avoir été séparées par électrophorèse 2D, les protéines ont été détectées par Western Blot à l'aide d'anticorps anti-AGE ou anti-HNE. Ceci a permis de mettre en évidence 7 spots cibles de la glycation et 7 spots cibles du 4-HNE avec l'âge dans les PBL. Certains, identifiés par spectrométrie de masse, sont des protéines du cytosquelette, des protéines impliquées dans la signalisation cellulaire ou dans le contrôle qualité des protéines. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons étudié l'effet du 4-HNE in vitro sur Hsc70 (cible du 4-HNE ex vivo). Concernant la structure primaire de la protéine, après 16h d'incubation avec 100 μM de 4-HNE, 2 cystéines, 2 histidines et 4 lysines sont modifiées. Six de ces résidus ont été identifiés par spectrométrie de masse : ils sont situés au niveau des domaines portant l'activité ATPase ou responsable de l'oligomérisation de la protéine. Contrairement à l'activité ATPase qui est préservée, la capacité à fixer des protéines substrats et la propriété d'oligomérisation d'Hsc70 sont altérées. Enfin, l'Hsc70 modifiée par le 4-HNE n'est pas mieux dégradée que la protéine native par le protéasome 20S mais elle agit différemment sur la protéolyse de la caséine, substrat du protéasome.

  • Titre traduit

    Protein oxidative modifications during ageing : detection and identification of protein targets in human peripheral blood lymphocytes and characterization of the effects of 4-hydroxy-nonenal on Hsc70 in vitro


  • Résumé

    Alterations of physiological functions and notably of immune function are a hallmark of ageing. So we interested of two oxidative modifications with age, protein glycation (AGE) and conjugation of proteins to lipid peroxydation products (4-HNE), in peripheral blood lymphocytes (PBL). Proteins from young and old donors were analyzed by a proteomic approach. Proteins are separated by 2D electrophoresis and then blotted on a nitrocellulose membrane before to be analyzed by Western Blot with antibodies raised against AGE and HNE. Thus, we detected 7 spots modifîed by glycation with age and 7 spots HNE-modifîed with age too. Some of them were identified by mass spectrometry: they are proteins from cytosqueleton and proteins implicated in transduction pathways or in proteins control quality. In the second part of this work, we have studied the effects of 4-HNE on structure and function of the protein chaperon Hsc70 (one target of 4-HNE identified ex vivo). Concerning thé amino acid composition of Hsc70, after 16h of incubation of Hsc70 with 100 μM of 4-HNE, 2 cysteines over 4,2 histidines over 7 and 4 lysines over 54 are modified. Six of these residus were identified by mass spectrometry. They are in N terminal ATPase domain and in the C-terminal oligomerization domain of Hsc70. However, the ATPase activity of Hsc70 is not altered. At the contrary, the abilities of Hsc70 to bind protein substrate and to oligomerize are decreased. At last, like native Hsc70, Hsc70 modified by the 4-HNE is not a better substrat for 20S proteasome but its effect on the proteolysis of casein, one substrate of 20S proteasome, is different.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (265 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : 573 réf.

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  • Bibliothèque : Université Paris Diderot - Paris 7. Service commun de la documentation. Bibliothèque Universitaire des Grands Moulins.
  • PEB soumis à condition
  • Cote : TS (2009) 093
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