Transplantation cellulaire dans le muscle squelettique : suivi de greffes de myoblastes à l'aide de l'imagerie par Résonance Magnétique Nucléaire SMALD/34-, une nouvelle catégorie de progéniteurs myogéniques

par Karine Vauchez

Thèse de doctorat en Thérapeutiques biotechnologiques

Sous la direction de Marc Yves Fiszman et de Jean-Thomas Vilquin.

Soutenue en 2009

à Paris 7 .


  • Résumé

    Alors que la thérapie cellulaire dans le muscle squelettique représente un domaine de recherche en pleine expansion, de nombreux problèmes restent encore à résoudre avant d'obtenir un traitement efficace, notamment pour l'utilisation chez des patients atteints de maladies neuromusculaires. Parmi ces problèmes, citons la surmortalité cellulaire, l'absence de migration des cellules injectées, le rejet immunologique, les difficultés de suivi d'implantation et l'inefficacité relative de certains types cellulaires. Ce travail de thèse sur la transplantation cellulaire dans le muscle squelettique s'est donc articulé autour de 2 axes de recherche : (1) Le suivi de greffes de myoblastes à l'aide de l'Imagerie par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) et (2) La mise en évidence d'une nouvelle catégorie de progéniteurs myogéniques. Grâce à une haute résolution spatiale, l'imagerie par RMN devient un outil de suivi non invasif des protocoles de thérapie cellulaire. Préalablement à la transplantation, les cellules doivent être chargées avec un agent de contraste. La plupart des études utilisent les particules d'oxyde de fer qui offrent une forte sensibilité de détection. Dans un premier temps, nous avons validé un modèle de xénotransplantation de myoblastes humains dans le muscle squelettique de souris garantissant une élimination complète et rapide des cellules injectées. Ensuite, nous avons utilisé ce modèle pour évaluer les ferrites en tant que traceurs des cellules transplantées, A l'aide d'analyses histologiques, nous avons observé une disparition totale des cellules humaines en 6 jours alors que les particules de fer restaient détectables au niveau du site d'injection et colocalisaient avec les cellules murines infiltrées (macrophages) ou avoisinantes. Dans un second temps, utilisant ce même modèle, nous avons comparé l'évolution par RMN des contrastes induits par les cellules chargées soit en ferrites, soit en Gadolinium-DTPA (agent de contraste non particulaire), à la persistance des cellules humaines. Pendant 3 mois, le signal a régulièrement été évalué selon (1) la taille de l'aire marquée et (2) son contraste relatif par rapport au tissu environnant. En parallèle, une analyse immunohistochimique a permis d'évaluer la présence des cellules humaines. L'analyse des données a révélé que les modifications des contrastes ne reflétaient pas avec exactitude la présence des cellules greffées. En effet, le contraste induit par les ferrites était toujours visible 3 mois post-injection. L'utilisation des ferrites comme agent de contraste s'est donc révélée inadaptée et peut amener à des interprétations erronées dans les cas de mort cellulaire au cours de la transplantation. Bien que la rémanence du Gd-DTPA soit retardée (15 jours post-injection) par rapport au rejet des cellules, une élimination plus rapide associée à une quantification possible du signal convergent en faveur de l'utilisation de ce dernier en contrepartie des SPIOs. Les hypothèses concernant ces différences de comportements sont discutées. L'utilisation de progéniteurs myogéniques présentant de forts potentiels de survie, de prolifération et de régénération in vivo pourrait influencer positivement les résultats des traitements de thérapie cellulaire, et l'hétérogénéité du tissu musculaire justifie la recherche de nouveaux marqueurs de cellules primitives. L'aldéhyde déshydrogénase (ALDH) est connue pour être un marqueur de cellules souches hématopoïétiques, neurales ou épithéliales mammaires. Le second axe de recherche de ce travail de thèse a eu pour but d'identifier, le cas échéant, des populations cellulaires exprimant l'ALDH dans le muscle squelettique. Ainsi, l'ALDH s'est révélée correspondre à un marqueur d'une population cellulaire isolée à partir de biopsies musculaires humaines que nous avons appelés les SMALD. Deux sous-populations de SMALD présentaient des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles différentes. Alors que les SMALD/34+ étaient plutôt associées à un profil de cellules mésenchymateuses, les SMALD/34-, n'exprimant pas le CD56 en initial, s'engagaient dans le lignage myogénique et présentaient un potentiel régénératif in vivo. Triées puis injectées en intramusculaire, elles ont été capables de proliférer in vivo avant de participer à la régénération du muscle lésé. Les SMALD/34- correspondent donc à une nouvelle population de progéniteurs musculaires non décrits à ce jour et pourraient être envisagées comme un outil de thérapie cellulaire pour pallier différentes maladies musculaires dégénératives. Cependant, leur amplification in vitro reste problématique puisque, dans nos conditions de culture, elles perdent leur phénotype initial de cellules ALDH+/34-/56-. Ceci reste, pour le moment, un obstacle majeur pour une utilisation à grande échelle. Cette étude princeps ouvre cependant la voie à différents types d'investigations dans les domaines de la biologie cellulaire, de la biologie moléculaire, et enfin celui des thérapeutiques.

  • Titre traduit

    Cellular transplantation in skeletal muscle : Follow up of graffed myoblasts with the help of Nuclear Magnetic Resonance Imaging SMALD/34- : the highlighting of a new type of myogenic progenitor


  • Résumé

    Cell therapy is a research field in rapid expansion, but the results are hampered by several problems which need solutions, before to represent a potential treatment, especially directed to patients with neuromuscular disease. Among theses problems, are the high level of cell death, the lack of injected cells migration, the immunological rejection, the difficulties of following up the fate of injected cells, and the relative inefficiency of some cell types. The present doctoral study, while focused on cell transplantation in skeletal muscle was elaborated along 2 research axes: (1) The in vivo follow up of grafted myoblasts using tools of Nuclear Magnetic Resonance Imaging (NMR), and (2) The discovery and description of a new type of myogenic progenitor. With high special resolution, *H-NMR imaging is proposed to non-invasively monitor cell therapy protocols. Prior to transplantation, cells must be loaded with contrast agent. Most studies performed so far make use of iron oxide particles (SPIOs) because they offer a high detection sensitivity. In a first step, we validated a human-to-mouse xenotransplantation model warranting the complete and rapid rejection of the cells. Then we used this model to assess the appropriateness of SPIOs to track the transplanted cells. We observed the total disappearance of the human cells within 6 days while ferrite particles rernained detectable and co-localized with mouse infiltrating (macrophages) and neighboring cells at injection site. In a second step, we investigated in the same experimental model whether NMR signal changes induced by cells preloading with SPIOs or the low molecular weight Gadolinium-DTPA, accurately monitored transplanted cells outcome. During 3 months, label outcome was regularly evaluated by the size of the labeled area and its relative contrast to surrounding tissue. In parallel, immunohistochemistry assessed the presence of human cells. Data analysis revealed that contrast agent-induced signal changes did not strictly reflect the graft status. In fact, the contrast induced by SPIOs was still visible 3 months post-injection. The use of SPIOs as contrast agent was inadequate as it led to false interpretation in the case of acute cell death and rejection following transplantation. In spite of delayed Gd-DTPA remanence (15 days post-transplantation) in comparison to the cells persistence, the faster elimination and the quantifiable nature of the signal come together to promote the use of this last-one versus SPIOs. The hypotheses regarding the difference of behaviors are discussed. The use of muscular progenitor with high lifespan, proliferation rate and regeneration capacity in vivo would positively influence the results of cell therapy approaches. The skeletal muscle tissue is stamped by heterogeneity, which mandates the research of new primitive markers. The aldehyde dehydrogenase (ALDH) is known as a marker of hematopoietic, neural and epithelial mammary stem cells. The goal of this section of the doctoral work was to identify, if any, populations of cell expressing the ALDH in human skeletal muscles. We established that ALDH was expressed by, and therefore constituted a marker of a cell population extracted from human muscle biopsies. We called them the SMALD cells. Two sub-populations of SMALD cells showed different phenotypical and functional characteristics. While SMALD/34+ cells presented a profile of mesenchymal cells, the SMALD/34-, being initially negative for CD56 expression, were committed towards thé myogenic lineage and presented a regenerative potential in vivo. Upon sorting and intramuscular injection, they proliferated in vivo before taking part in muscular regeneration. The SMALD/34- cells corresponded to a new population of cells, yet undescribed to date. They could be considered as a therapeutic tool for neuromuscular diseases. Their amplification in vitro remains problematic since, in our culture condition, they loose their initial ALDH+/34-/56- phenotype. This represents a major barrier for a present use in large scale. Nevertheless, this first study opens the way to several types of investigations in the fields of cell-biology, molecular biology and therapeutics.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (369 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : 388 réf.

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  • Bibliothèque : Université Paris Diderot - Paris 7. Service commun de la documentation. Bibliothèque Universitaire des Grands Moulins.
  • PEB soumis à condition
  • Cote : TS (2009) 020
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