Etudes fonctionnelles et structurales de l'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique de lapin et de la protéine recombinante exprimée chez Saccharomyces cerevisiae

par Cédric Montigny

Thèse de doctorat en Biochimie et biophysique

Sous la direction de Philippe Champeil.

Soutenue en 2009

à Paris 6 .


  • Résumé

    L’ATPase-Ca2+ SERCA1a est une protéine membranaire qui permet le transport actif de deux calcium depuis le cytosol vers la lumière du réticulum. L’obtention récente de nombreuses structures à résolution atomique a été un atout majeur pour comprendre son cycle catalytique, les formes cristallisées de cette enzyme en absence de calcium ayant été obtenues en présence d’un inhibiteur. Nous avons montré, que l’interaction de la protéine avec ces inhibiteurs, avait induit des biais significatifs dans certaines formes cristallisées jusqu’en 2006. Nos résultats ont stimulé la recherche de structures nouvelles, dont l’analyse a pleinement confirmé nos conclusions. L’utilisation de ces inhibiteurs pendant la cristallisation de la protéine solubilisée était jusque là jugée utile pour la stabiliser en présence de détergent. Utilisant le glycérol pour ralentir cette inactivation, nous avons mis en évidence des conséquences de l’interaction avec l’ATPase de deux détergents. Nous avons également étudié trois mutants de l’ATPase, purifiés après expression hétérologue dans la levure S. Cerevisiae. En parallèle, nous avons l’étudié les propriétés de fluorescence d’une forme particulière de l’enzyme SERCA1a marquée au FITC dans son site nucléotidique, montrant une phosphorylation inattendue du FITC lié, cette phosphorylation impliquant une réorganisation des domaines cytosoliques de l’ATPase lors du relargage des ions calcium. Dans nos conditions expérimentales, nous avons tenu compte de la possible chélation des cations divalents interagissant avec l’enzyme par les molécules anioniques présentes. Nous avons vérifié que le magnésium n’était PAS chélaté par le tampon MOPS, contrairement à ce qui était écrit dans certaines tables de constantes d’association. En collaboration, nous avons aussi précisé les complexes formés par association entre le cadmium et le glutathion réduit, afin de mieux comprendre quels complexes pourraient se former au cours de la détoxication cellulaire du cadmium.

  • Titre traduit

    Functional and structural studies of the sarcoendoplasmic reticulum Ca2+-ATPse prepared in its native form rabbit muscle or heterologously expressed in the yeast S. Cerevisiae


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Informations

  • Détails : 1 vol. (IX-[278] p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 153-167. 432 réf. bibliogr.

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  • Bibliothèque : Université Pierre et Marie Curie. Bibliothèque Universitaire Pierre et Marie Curie. Section Biologie-Chimie-Physique Recherche.
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  • Cote : T Paris 6 2009 516
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