Etude du mécanisme de l'urate oxydase par diffraction des rayons X et spectroscopie RPE

par Laure Gabison

Thèse de doctorat en Biologie structurale

Sous la direction de Mohammed Chiadmi et de Thierry Prangé.

Soutenue en 2009

à Paris Descartes .


  • Résumé

    L'urate oxydase est une enzyme-clé de la voie de dégradation des purines. Cette protéine, dépourvue de cofacteur (organique ou métallique), dégrade en présence d'oxygène moléculaire l'urate (mono-anion de l'acide urique) en 5-hydroxyisourate avec formation de peroxyde d'hydrogène. Le 5-hydroxyisourate conduit finalement à l'allantoïne, spontanément, ou via deux protéines spécifiques. Ce mécanisme enzymatique, étudié depuis le début du XXeme siècle, n'a cependant toujours pas été complètement élucidé. L'utilisation de la diffraction des rayons X et la spectroscopie RPE permettent d'apporter un nouvel éclairage sur le mécanisme de l'urate oxydase. La spectroscopie RPE met en évidence le caractère radicalaire du mécanisme et amène à proposer l'état électronique de certains intermédiaires. Les études tridimensionnelles par diffraction des rayons X des complexes enzyme-inhibiteur à haute résolution, suggèrent une déprotonation de l'urate lors de la première étape du mécanisme, pour donner un intermédiaire di-déprotoné sur les atomes N3 et N7 de l'acide urique. Les différentes approches pour bloquer le substrat naturel dans le site actif, ont confirmé cet état de déprotonation, et ont également permis de proposer le dehydrourate comme intermédiaire réactionnel stable. Finalement les différentes tentatives infructueuses pour détecter l'intermédiaire hypothétique 5-hydroperoxyisourate, mis en avant dans la littérature, ont conduit à formuler l'hypothèse soit un passage direct de l'urate radicalaire au dehydrourate, soit un passage indirect via le 4-hydroperoxyisourate. Le dehydrourate est ensuite hydroxylé et libéré du site actif. A partir de l’ensemble de ces résultats, deux nouvelles alternatives du mécanisme sont suggérées

  • Titre traduit

    Mechanistic studies of the cofactor-less urate oxidase by X-Ray diffraction and EPR spectroscopy


  • Résumé

    Urate oxidase is a key enzyme of the purine degradation pathway. This protein work without cofactor (metallic nor organic) and catalyse in presence of molecular oxygen, the degradation of urate (uric acid mono-anion) into 5-hydroxyisourate with release of hydrogen peroxide. 5-hydroxyisourate finally decomposes spontaneously or via two specific proteins to allantoïne. Urate oxidase mechanism is studied since the beginning of the century and it still remains nottotally understood. X-Ray diffraction and EPR spectroscopy allow bringing new lighting on urate oxidas mechanism. EPR spectroscopy shows the radical character of the mechanism and brings to propose the electronic state of some intermediate. Tridimensional studies by x-ray diffraction of high resolution inhibitor-enzyme complexes suggest urate déprotonation for the first step of the mechanism to give di-deprotonated intermediate on N3 and N7 atoms of uric acid. Several approach to block the natural substrate in the active site confirm deprotonated state and also permit to propose dehydrourate as stable relational intermediate. Finally different fruitless attempts to detect the hypothetic 5-hydroperoxyisourate intermediate from literature drove to formulate hypothesis of a direct passage to dehydrourate or generation of 4-hydroperoxyisourate. Dehydrourate is the hydroxyled and un-complexe from the active site. From all the result two news alternative mechanism were suggested

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Informations

  • Détails : 1 vol. (181 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 175-180

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  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire de santé (Paris). Pôle pharmacie, biologie et cosmétologie.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TPHB 10703
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