Régulation post-transcriptionnelle et post-traductionnelle de DUSP6, une phosphatase des MAP kinases ERK 1/2

par Olga Bermudez

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Clotilde Gimond et de Gilles Pagès.


  • Résumé

    Les MAP kinases phosphatases (MKPs) appartiennent à la famille des Dual-Specificity Phosphatases (DUSP) et déphosphorylent les résidus thréonine et tyrosine des MAP kinases activées. DUSP6/MKP-3 est une phosphatase cytoplasmique qui déphosphoryle et donc inactive de façon spécifique les MAP kinases ERK1/2. DUSP6 a un rôle important au cours du développement, particulièrement dans la régulation du signal induit par le FGF, et son absence provoque des effet phénotypiques majeurs chez la Drosophile, le poulet, le poisson-zèbre et la souris. DUSP6 pourrait jouer également un rôle important au cours de la formation et du développement des tumeurs car son expression se trouve altérée dans divers cancers. Pour ces raisons, je me suis intéressée aux mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de son expression, au niveau post-transcriptionnel et post-traductionnel. Des données antérieures du laboratoire ont indiqué que DUSP6 était phosphorylée et dégradée après stimulation des cellules avec des facteurs de croissance, de façon MEK/ERK-dépendante (Marchetti et al. , 2005). Dans la première partie de ma thèse, j’ai étudié le rôle d’autres voies de signalisation dans la régulation de DUSP6. Nous avons montré qu’une autre voie de signalisation, la voie PI3K/mTOR, est responsable d’une partie de la phosphorylation et de la dégradation de DUSP6 induite par les facteurs de croissance (Bermudez et al. , 2008). Toutefois, une activité basale de MEK est nécessaire pour que la phosphorylation de DUSP6 par mTOR ait lieu. Des études de mutagenèse ont montré que la sérine 159 est le résidu phosphorylé par mTOR. La phosphatase DUSP6 pourrait donc constituer un nouveau point d’interaction entre deux grandes voies de signalisation cellulaire activées par les facteurs de croissance, la voie MEK/ERK et la voie PI3K/mTOR. Dans la deuxième partie de mon travail, je me suis intéressée à la régulation de dusp6 au niveau de son ARNm. D’autres équipes ont montré que la voie MEK/ERK jouait un rôle dans l’activation transcriptionnelle de dusp6. Nous avons confirmé que l’inhibition de MEK/ERK réduit fortement les quantités d’ARNm de dusp6. Afin d’étudier la régulation de la stabilité de l’ARNm de dusp6, nous avons cloné dans un vecteur d’expression un gène rapporteur luciférase en amont de la région non codante 3’UTR de dusp6, qui contient des sites consensus pour différents facteurs qui déstabilisent/stabilisent les ARNm. Nous avons trouvé que la voie MEK/ERK stabilise l’ARNm de dusp6. Par ailleurs, des conditions d’hypoxie, une caractéristique de nombreuses tumeurs in vivo, induisent une augmentation des niveaux d’ARNm de dusp6, augmentation qui dépend de HIF-1alpha. Finalement, nous avons identifié deux facteurs qui déstabilisent l’ARNm de dusp6, TTP (tristetraprolin) et PUM2, un homologue du gène pumilio de la drosophile. Les résultats présentés dans cette thèse montrent donc que la voie MEK/ERK est impliquée dans la régulation de DUSP6 à différents niveaux, de la régulation de son ARNm au niveau post-traductionnel, dans une boucle de rétrocontrôle. L’étude de la régulation de DUSP6 apporte des éléments supplémentaires pour la compréhension des mécanismes complexes impliqués dans l’activation d’ERK1/2 au sein du réseau de signalisation des MAPKs, où des régulations positives et négatives contribuent à un contrôle subtil de l’activation des MAP Kinases ERKs dans l’espace et le temps.

  • Titre traduit

    Regulation of the ERK 1/2 phosphatase DUSP6 MKP-3 at the post-transcriptional and post-translational level : insights into a complex signalling networks


  • Résumé

    MAP kinases phosphatases (MKPs) belong to the Dual-Specificity Phophatase family (DUSP) and dephosphorylate phospho-threonine and phospho-tyrosine within MAP kinases. DUSP6/MKP-3 is a cytoplasmic phosphatase that specifically dephosphorylates and inactivates the MAP Kinases ERK ½. DUSP6 has an important role during animal embryogenesis, specially in the regulation of FGF signaling, and its absence leads to major phenotypic effects in Drosophila, chicken, zebrafish and mice. The expression of DUSP6 can also be regulated in some cancers: its expression is upregulated in melanoma and myeloma but downregulated in invasive stages of pancreas cancer. Given the importance of dusp6 regulation in physiological and pathological cases, I focused my attention on studying the molecular mechanisms underlying the expression of dusp6. As the transcriptional regulation of dusp6 has been previously reported, I concentrated on dusp6 mRNA stability and the degradation of the protein DUSP6. Previous results in the lab have shown that at the protein level, DUSP6 was phosphorylated and degraded upon growth factor stimulation, in a MEK-dependent manner (Marchetti et al. , 2005). In the first part of my PhD, I studied the role of other signaling pathways in DUSP6 regulation and I showed that another pathway involved in growth factor signaling, the PI3K/mTOR signaling pathway, also accounts for a part of the phosphorylation and degradation of DUSP6 induced by serum growth factors (Bermudez et al. , 2008, Oncogene). However, a basal activity of MEK was required for the mTOR pathway-mediated phosphorylation to occur. Mutagenesis studies identified serine 159 within DUSP6 as the target of the mTOR pathway. The ERK phosphatase DUSP6 may thus constitute a novel branch-point of the cross-talk between two major signaling pathways induced by growth factors, the MEK/ERK pathway and the PI3K/mTOR pathway. In a second part of my work, I investigate the molecular basis of dusp6 regulation at the mRNA level. Others have shown a role for the MEK/ERK pathway in transcriptional activation of dusp6, and we confirmed that their inhibition strongly diminished the amount of dusp6 mRNA. To determine whether the stability of dusp6 mRNA could be subjected to regulation, a luciferase reporter was cloned upstream of the non coding 3’UTR of dusp6, which contains consensus sequences for various stabilization/destabilization factors. The MEK/ERK pathway was found to stabilize dusp6 mRNA. Hypoxic conditions, a hallmark of many tumors in vivo, induce a modest but reproducible increase in dusp6 mRNA levels, which is HIF1-alpha dependent. Consistent with increased dusp6 mRNA levels in hypoxia, we found that pERK levels are diminished under hypoxia in several albeit not all cancer cell lines tested. Finally, I identified two different mRNA-binding proteins, tristetraprolin (TTP) and PUM2 as factors destabilizing dusp6 mRNA. Altogether, these results indicate that the regulation of DUSP6 involves the MEK/ERK pathway at different levels, at the mRNA level as well as at the post-translation level, in a feedback loop. The study of dusp6 expression brings additional information about the complex mechanisms involved in ERK1/2 activity within the network of MAPKs, where positive and negative regulations lead to a subtle but tight control of ERK activation in space and time.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (179 f.)
  • Annexes : Bibliogr. f. 157-179. Résumés en français et en anglais

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  • Bibliothèque : Université Nice Sophia Antipolis. Service commun de la documentation. Section Sciences.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : 09NICE4054
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