Comportement dynamique au centrosome de la tyrosine kinase Syk, un nouveau suppresseur de tumeur dans le sein : étude par microscopie à haute résolution

par Guillaume Fargier

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire

Sous la direction de Philippe Montcourrier et de Peter Coopman.

Soutenue en 2009

à Montpellier 2 .


  • Résumé

    Très étudiée pour son rôle dans la signalisation des immuno-récepteurs, la tyrosine kinase Syk agirait comme suppresseur de tumeur et de métastase dans l'épithélium mammaire. Le mécanisme de cette activité anti-oncogénique reste inconnu. En plus de la localisation cytoplasmique, Syk est localisée aux extensions membranaires et au centrosome où elle est catalytiquement active, avec une variation de la concentration au cours du cycle cellulaire. Les localisations de mutants de Syk dans la cellule dépendent du type du site tyrosine muté d'une part, et les effecteurs potentiels de Syk reconnus par analyse protéomique d'autre part, font penser à un code de phosphorylation qui dépendrait du résidu tyrosine activé pour cibler la kinase à des sites sub-cellulaires différents. Afin de caractériser la dynamique des échanges de Syk entre compartiments subcellulaires et surtout dans le centrosome, nous avons employé des approches d'imagerie à haute résolution sur cellules vivantes de cancer du sein transfectées par des formes sauvage ou mutantes de DsRed-Syk. L'approche de FRAP et l'utilisation d'une chimère photo-activable (PA-GFP-Syk) montrent que Syk est recrutée activement au centrosome, avec un τ de 18,54 ± 3,63 sec. L'utilisation d'inhibiteurs de polymérisation de microtubules ou du moteur moléculaire dynéine/dynactine, la visualisation par TIRF des déplacements de particules de Syk à la base des cellules, la co-localisation par immunofluorescence, l'observation confirmée par modélisation d'une dérive directionnelle de PA-GFP-Syk après activation, tout indique que cytosquelette microtubulaire et moteur moléculaire sont nécessaires pour le recrutement de Syk au centrosome.

  • Titre traduit

    Dynamic behavior at the centrosome of the Syk tyrosine kinase, a novel tumor suppressor in breast cancer : High resolution microscopy study


  • Résumé

    Initially studied for its role in immunoreceptor-mediated downstream signalling, the tyrosine kinase Syk acts like a tumor and metastasis suppressor within breast cancer cells. The mechanism of its anti-oncogenic activity remains, however, to be identified. In addition to its cytoplasmic localization, Syk is also visualized at plasma membrane extensions and at the centrosome in which it exhibits a catalytic activity and is tightly regulated along the cell cycle. Considering both the action sites of potential effectors as identified by proteomic approach and differently targeted DsRed-Syk following the tyrosine residue mutated, we hypothesize a phosphorylation code targeting the kinase at different sub-cellular compartments depending on the tyrosine residue activated. In order to determine whether a dynamic exchange occurs between the subcellular compartments, we applied different imaging techniques on living breast cancer cells transiently expressing wild-type and mutant fluorescent Syk chimeras. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) with DsRed-Syk and photoactivatable GFP-Syk clearly evidenced rapid exchanges at the centrosomes with a recruitment τ of 18,54 ± 3,63 sec. Treatments affecting the microtubule skeleton or the molecular motor dynein, TIRF imaging of Syk clusters, antibody co-localization, directional drift of activated PA-GFP-Syk corroborated by mathematical modelling, together show that the tubulin cytoskeleton and the microtubule motor dynein/dynactin are necessary for Syk recruitment at the centrosome.

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  • Annexes : Bibliogr. p. 136-141. Annexes

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