Identification spectrale et quantification de microorganismes dans les échantillons d'eau : applications aux Legionella

Spectral identification and quantification of microorganisms in water samples : applications to legionella

• Auteur / Autrice : Xaviera Pennanec
• Direction : Karine Vallée Réhel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie. Biologie. Santé
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Lorient
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Santé, information-communication et mathématiques, matière (Brest, Finistère)
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université européenne de Bretagne (2007-2016)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Legionella pneumophila

Identification

Légionelles

Analyse quantitative (chimie)

Spectrométrie de masse

Eau -- Bactériologie

Mots clés libres

Maldi-ToF

Q-pcr

Résumé

Le risque d'épidémie de légionellose doit être pris au sérieux, puisque 2000 à 3000 cas de cette maladie sont recensés chaque année en France, dont 10 à 15% s'avèrent mortels. Cette maladie est due à des bactéries appartenant au genre Legionella, qui inclut 47 espèces différentes, mais Legionella pneumophila sgl est responsable à elle seule de 90% des infections. Pour réduire les risques d'infection de légionellose, un suivi régulier des réseaux d'eau est indispensable ; c'est pourquoi l'AFNOR a publié en avril 2006 un projet de norme qui prévoit une ''détection et une quantification des Legionella et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction en chaîne de polymérisation (PCR)''. Elle remet en cause les analyses de l'eau telles qu'elles sont réalisées aujourd'hui. Selon la norme utilisée actuellement relative à la détection et la quantification des légionelles par filtration et mise en culture, il faut 10 jours d'incubation pour obtenir des résultats définitifs. Ces temps d'analyse peuvent être réduits de façon significative en couplant la méthode de PCR en temps réel développée dans la nouvelle norme, avec la spectrométrie de masse MALDI-ToF. L'analyse se fera donc en deux étapes : 1- Un criblage rapide des bactéries présentes dans l'échantillon par spectrométrie de masse MALDI- ToF. Cette technique est afficace et rapide pour la détection et l'identification des bactéries. En effet, les cellules bactériennes entières sont analysées sans étape de lyse. 2- En cas de présence de légionelles, une quantification des légionelles en générale et de Legionella pneumophila en particulier par q-PCR.

The epidemic risk for legionellosis is very serious, indeed 2,000 to 3,000 cases ofthis illness are counted each year in France; JO to 15% ofthem are fatal. This disease is due to the bacteria from the Legionella genus, which includes 47 different species, but Legionella pneumophila sg 1 is responsible for 90% of the infection. To reduce contamination risks, a steady follow-up ofwater network is essential. That is why, the A. F. NOR. Has published in April 2006 a standard project on the « Detection and quantification of Legionella and/or L. Pneumophila by concentration and genic amplification by polymerase chain reaction (PCR) ». It questions the CUITent carrying out of water analysis. According to the cUITently used standard on detection and quantification of Legionellae by filtration and culture, 10 days are needed to have final results. This analysis time can be significantly reduced by coupling the quantitative PCR (q-PCR), developed in the new standard, wih MALDI-ToF mass spectrometry. Analyses will require two steps : 1- A quick screening of bacteria in the sample by MALDI- ToF mass spectrometry. This technique is efficient and fast for the detection and identification ofbacteria. Lndeed, whole bacterial cells are analyzed without Iysis step 2- If Legionella are detected, their quantification is carried out in general and more particularly for L. Pneumophila by q-PCR. Two probes are used, one specific for Legionella spp. And the other for L. Pneumophila. This step allows the quantification of these two kinds of species. The combination of these two techniques is particularly interesting in the cost and time-consuming aspects.