Caractérisation et utilisation de l'activité méthylmalonyl-CoA mutase chez Corynebacterium glutamicum

par Laure Botella

Thèse de doctorat en Ingénierie microbienne et enzymatique

Sous la direction de Nicholas David Lindley.

Soutenue en 2009

à Toulouse, INSA .


  • Résumé

    Corynebacterium glutamicum has a very high capacity for the production of metabolites derived from central metabolism in which the citric acid cycle occupies a key position for the delivery of precursors for biosynthetic purposes. Succinyl-CoA is an intermediate of this cycle and this can in principle be isomerized to methylmalonyl-CoA by methylmalonyl-CoA mutase (MCM). The radical reaction catalysed by MCM is reversible and coenzyme B12-dependent. The classical MCM is a dimer. However, recently the existence of a third subunit functioning to protect the enzyme from inactivation has been discovered. The three genes encoding MCM have a syntenic organization in Corynebacterineae and are the genes NCgl1471, NCgl1472 and NCgl1470 in C. Glutamicum. Plasmids have been constructed enabling the over-expression of the three mutase encoding genes in C. Glutamicum, as well as their deletion. An enzyme assay using methylmalonyl-CoA as substrate has shown that the enzyme is functional in vitro and that its activity is dependent on the presence of coenzyme B12. A C. Glutamicum mutant strain deleted for the three genes has revealed that the mutase is not necessary for the growth on either complex medium, or on minimal medium with glucose, acetate or propionate as a carbon source. Quantification of the methylmalonate content of C. Glutamicum during growth on glucose or acetate showed accumulation of this compound, independent of the presence of mutase or coenzyme B12 addition. During growth on propionate, levels of methylmalonate were 5-fold increased as compared to glucose and these decreased dramatically when MCM was active. Simultaneously, succinate accumulated extracellularly and after initially faster growth, further growth was abolished. Thus MCM is active in vivo in C. Glutamicum and the equilibrium of its reaction is in the direction of succinyl-CoA. Therefore, MCM enables reactions in parallel to the methylcitrate cycle for propionate utilization, where propionyl-CoA is apparently carboxylated to the (S) form of methylmalonyl-CoA, epimerized to (R)-methylmalonyl-CoA, and eventually isomerized by MCM activity to succinyl-CoA. MCM activity has been applied in combination with two enzymes from other organisms in a synthetic pathway for 3-hydroxyisobutyrate (3-HIB) production in C. Glutamicum. In this context, MCM was initially suggested to provide methylmalonyl-CoA, substrate for the heterologous enzymes. It was however observed and confirmed, that the equilibrium of the reaction does not favour this role for the mutase on glucose which is even deleterious towards 3-HIB production when propionate is used as carbon source. Use of the heterologous enzymes enabled formation of 3-HIB in detectable quantities when propionate was present though further production would require deletion of MCM activity

  • Titre traduit

    Characterization and use of methylmalonyl-CoA mutase activity in Corynebacterium glutamicum


  • Résumé

    Corynebacterium glutamicum possède une grande capacité de production de métabolites issus du métabolisme central. Dans ce contexte, le cycle de l’acide citrique ou cycle de Krebs occupe une position clé en tant que fournisseur de précurseurs pour la biosynthèse de nombreux composés. Le succinyl-CoA, intermédiaire du cycle de Krebs, peut être isomérisé en méthylmalonyl-CoA par la méthylmalonyl-CoA mutase (MCM). La réaction radicalaire catalysée par la MCM est réversible et dépendante du coenzyme B12. La MCM se compose classiquement de deux sous-unités, bien que l’existence d’une troisième sous-unité protégeant l’enzyme contre l’inactivation ait été caractérisée récemment. Chez les Corynebacterineae, les trois gènes codant pour la MCM, i. E. NCgl1471, NCgl1472 et NCgl1470 chez C. Glutamicum, ont une organisation synténique. Des plasmides permettant la surexpression des trois gènes codant pour la mutase ainsi que leur délétion dans C. Glutamicum ont été construits. Un essai enzymatique utilisant le méthylmalonyl-CoA comme substrat a montré que l’enzyme est fonctionnelle in vitro et que son activité est dépendante de la présence de coenzyme B12. L’étude d’un mutant de délétion pour les trois gènes a révélé que la mutase n’est nécessaire à la croissance de C. Glutamicum ni en milieu complexe, ni en milieu minimal contenant du glucose, de l’acétate ou du propionate en tant que source de carbone. Au cours de la croissance sur milieu supplémenté en glucose ou en acétate, C. Glutamicum accumule le méthylmalonate de façon indépendante à la présence de la mutase ou à l’addition de coenzyme B12 dans le milieu. Lors de la croissance sur milieu supplémenté en propionate, la concentration de méthylmalonate intracellulaire est 5 fois plus importante comparativement au même milieu supplémenté en glucose. De façon intéressante, lorsque la MCM est active, la concentration de méthylmalonate diminue drastiquement, du succinate s’accumule dans le milieu de culture et la croissance de la souche est rapidement stoppée. Ainsi la MCM est active in vivo chez C. Glutamicum et l’équilibre de la réaction est favorable à la formation de succinyl-CoA. La MCM représente une voie de métabolisation du propionate alternative au cycle du méthylcitrate. Cette dernière assurerait la carboxylation du propionyl-CoA en (S)-méthylmalonyl-CoA, qui serait épimérisé en (R)-méthylmalonyl-CoA avant d’être isomérisé en succinyl-CoA par la méthylmalonylCoA mutase. Par ailleurs, la MCM a été utilisée en combinaison avec deux enzymes provenant d’autres organismes, dans une nouvelle voie pour la production de 3-hydroxyisobutyrate (3-HIB) chez C. Glutamicum. Dans ce contexte, le rôle initialement suggéré pour la MCM consistait, à partir du succinyl-CoA issu du cycle de Krebs, en la formation de méthylmalonyl-CoA, substrat pour les deux enzymes hétérologues. Cependant, l’application de cette voie lors de la croissance sur milieu supplémenté en glucose a confirmé qu’un tel rôle n’est pas favorisé par l’équilibre de la réaction catalysée par la mutase in vivo. En outre, la production de 3-HIB en présence de propionate, résultat de l’activité des deux enzymes hétérologues, est diminuée lorsque la MCM est surexprimée. Ainsi, la délétion de l’activité MCM dans une souche recombinante de C. Glutamicum exprimant ces deux enzymes hétérologues constitue une voie prometteuse pour la production de 3-HIB

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Informations

  • Détails : 1 vol. (179 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 165-179

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  • Bibliothèque : Institut national des sciences appliquées. Bibliothèque centrale.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 2009//BOT
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