Intérêt thérapeutique de la protéine A20 des orthopoxvirus comme cible pertinente d'apatamères peptidiques et de compsés chimiques bloquant ses intéractions essentielles à l'intérieur du complexe de réplication virale

par Laurent Saccucci

Thèse de doctorat en Virologie. Immunologie

Sous la direction de Daniel Garin.

Soutenue en 2009

à l'Université Joseph Fourier (Grenoble) .


  • Résumé

    La variole est l'un des pires fléaux qu'ait connu l'humanité jusqu'à son éradication en 1980. Il existe aujourd'hui une menace terroriste de réémergence du virus de la variole comme arme biologique. Le manque de moyens thérapeutiques, la faible immunité de la population mondiale depuis l'arrêt de la vaccination antivariolique et les complications post-vaccinales liées à l'utilisation du vaccin réplicatif historique ont conduit ces dernières années à une intensification des recherches pour lutter contre la variole et les autres virus du genre orthopoxvirus. En complément d'assurer la production d'un nouveau vaccin antivariolique répondant aux normes sanitaires actuelles, il est indispensable de développer des molécules antivirales efficaces aux modes d'actions différents, utilisables immédiatement en cas d'attaque terroriste et pour pallier les complications post-vaccinales. L'objectif du travail de thèse est d'explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques en ciblant plus particulièrement la réplication du virus de la vaccine, utilisé comme modèle substitutif au virus de la variole. La première stratégie est l'utilisation d'aptamères peptidiques ciblant A20, une protéine centrale du complexe de réplication formant avec l'uracile ADN glycosylase D4 le facteur de processivité pour l'ADN polymérase virale. Ces peptides sont sélectionnés in vivo en double-hybride en levure pour interagir avec une cible protéique et potentiellement l'inhiber. Ainsi nous avons sélectionné un aptamère interagissant avec une région critique de la protéine cible A20 et capable d'inhiber significativement la réplication du virus de la vaccine en culture cellulaire. La seconde stratégie est l'utilisation d'un criblage haut débit de molécules chimiques pour leur capacité à rompre les interactions entre notre cible de choix A20 et deux de ses interacteurs connus, la protéine D4 et la primase/hélicase D5, par une approche basée sur l'utilisation de deux rapporteurs luciférase en levure. Nous avons démontré que deux molécules issues du criblage permettaient l'inhibition significative et spécifique de la réplication de plusieurs orthopoxvirus, in vitro. Ces travaux viennent compléter le faible arsenal thérapeutique disponible destiné à lutter contre les infections à orthopoxvirus.


  • Résumé

    Variola virus (VARV), the etiologic agent of smallpox was responsible of the most devastating infectious disease. Because of successful preventive measures by immunization, the World Health Organization (WHO) declared global eradication of smallpox in 1980. The subsequent discontinuation of vaccination has rendered all children and many adults virtually susceptible to smallpox infection. If variola virus was used in an act of terrorism or warfare it could cause a real catastrophe. So it is essential to develop new antiviral molecules with different mechanisms of action and usable immediately in case of terrorist attack. Here we report the use of two original strategies to identify new effective anti-orthopoxvirus agents targeting specifically the viral replication complex of vaccinia virus (VACV), a valuable surrogate for the smallpox virus. First, through a yeast two-hybrid assay, we have selected peptide aptamers directed against the VACV A20 protein, a central component of the replication complex and shown to form, with the D4 protein, a processivity factor for the viral DNA polymerase. Peptide aptamers are combinatorial protein molecules designed to inhibit the function of target proteins in living cells. We have proved that one selected aptamer interacting with a central region of A20 was able to significantly inhibit viral DNA synthesis and viral production in cell culture. Second, we have performed a high-throughput screening of small molecules to isolate compounds capable of disrupting A20 interaction with either D4, an uracil DNA glycosylase or D5, a DNA-independent nucleoside triphosphatase (NTPase) that contains a helicase domain. The screen is based on an automated dual-luciferase yeast two-hybrid assay, performed in 384-well plates. Among a collection of 27,600 compounds from diverse commercial chemical libraries we have identified two potential inhibitors that exhibit antipoxvirus effect on infected cell culture. These compounds were also found to specifically inhibit DNA replication. Thus, the screening for inhibitors of protein-protein interactions within viral replication complex remains to be a promising strategy for identifying new compounds active against orthopoxvirus infections.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (112 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. 189 réf.

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  • Bibliothèque : Service interétablissements de Documentation (Saint-Martin d'Hères, Isère). Bibliothèque universitaire de Sciences.
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  • Cote : TS09/GRE1/0338/D
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