Structural characterisation of human kinases using a library-based construct screening approach

• Auteur / Autrice : Hayretin Yumerefendi
• Direction : Darren Hart
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Grenoble 1

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biologie moléculaire

Protéines kinases

Résumé

Obtenir des quantités suffisantes de protéines solubles est souvent un obstacle à la caractérisation structurale des protéines. Une approche pour surmonter cela est d'isoler des domaines protéiques en utilisant des méthodes itératives de création et d'analyse de constructions. Un moyen d'y parvenir consiste à créer, par troncation enzymatique, des banques d'ADN, contenant toutes les constructions possibles d'une même protéine, et à tester à la fois l'expression et la solubilité de celles-ci. Durant la réalisation de cette thèse, une nouvelle méthode, appellée ESPRIT pour Expression of Soluble Proteins by Random Incremental Truncation, a été utilisée pour définir des domaines protéiques. Plusieurs protéines kinases avec des domaines multiples, essentiels aux fonctions cellulaires et dont la production sous une forme soluble avait échoué auparavant, ont été analysées par cette nouvelle technologie. Cette méthode a d'abord été optimisée pour améliorer la qualité et l'efficacité des banques permettant un meilleur traitement de la diversité des constructions générées. Elle a ensuite été appliquée à une protéine kinase modèle DAPK1, pour laquelle une définition précise de domaine a été démontrée. Des petites variations de constructions ont donné des stabilités thermiques et des assemblages cristallins différents permettant ainsi la cristallisation dans des conformations différentes. La méthode a aussi été appliquée pour identifier des variants solubles du complexe DAPK1 et son partenaire la calmoduline, permettant de mettre en évidence un domaine d'intéraction minimal, plus petit que celui décrit auparavant. Alors que plusieurs tentatives pour obtenir le domaine catalytique kinase de IKKβ avaient échoué, des criblages additionnels sur cette protéine avec cette méthode ont permis d'identifier des domaines de régulation solubles et fonctionnels in vivo. Enfin, il a été démontré que des constructions du domaine catalytique de p110β, faiblement exprimées dans E. Coli, pouvaient être exprimées solubles dans des cellules d'insectes avec des rendements plus importants.

Structural characterisation of proteins is often hindered by insufficient amounts of soluble material. A common approach addressing this problem is to isolate their separate domains, classically done by time-consuming iterations of design, generation and testing of constructs. An alternative approach is to generate a random library of all possible constructs by enzymatic DNA truncation and test them in one experiment for expression and solubility. In this work, the novel, directed evolution-type method Expression of Soluble Proteins by Random Incremental Truncations (ESPRIT) was used to explore the definition of proteins domains. The biological focus was a set of multidomain protein kinases that has previously resisted soluble over-expression and structural characterisation. First, improvements in the method were developed to improve the quality and efficiency of the truncation librairies leading to better coverage of the diversity. Then, its application on a more characterised protein, DAPK1, demonstrated precise domain definition. Small variations of the constructs resulted in significantly different thermal stability and crystal packing, thus providing a means to resolve a structure with an alternative conformation. The method was also used for the identification of soluble variants of the complex between DAPK1 and its partner calmodulin where the minimal interaction region was shorter than previously report. The application of the method to a series of difficult-to-express protein kinases resulted in rapid identification of incompatibility with E. Coli over-expression for some of the targets. While attempts to rescue the low solubility the IKKβ kinase catalytic domain were unsuccessful, additional screens on this protein identified soluble and regulatory domains that showed some functionality in vivo. Finally, it was demonstrated that constructs of the PI3Kβ p110β catalytic domain with residual solubility in E. Coli, identified from screening, could be expressed in insect cells at higher yields in soluble form.