Transporteur mitochondrial d'ATP/ADP : étude par échange hydrogène / deutérium couplé à la spectrométrie de masse et caractérisation de mutations pathogènes

par Martial Rey

Thèse de doctorat en Biologie structurale et nanobiologie

Sous la direction de Gérard Brandolin.

Soutenue en 2009

à l'Université Joseph Fourier (Grenoble) .


  • Résumé

    Le tran'sporteur d'ADP/ATP est une protéine de la membrane interne mitochondriale qui joue un rôle physiologique majeur en catalysant l'échange d'un ADP cytoplasmique contre un A TP néo-synthétisé dans la matrice mitochondriale. Cette protéine peut être inhibée de manière très spécifique par deux poisons naturels, le carboxyatractyloside (CATR) et l'acide bongkrekique (BA) qui stabilisent la protéine dans deux états conformationnels distincts adoptés au cours du mécanisme de transport. Afin de mieux appréhender cette dynamique fonctionnelle, une étude du transporteur d'ADP/ATP bovin en complexe avec le CATR ou le BA dans le détergent Triton X-IOO a été réalisée par échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse. Ces travaux se sont déroulés en 4 parties. La première a consisté à adapter cette technique à l'étude des protéines membranaires intégrales. En effet, la présence de détergents, nécessaires au maintien en solution de l'état natif de ces protéines, n'a pas permis jusqu'ici de les étudier par cette approche. Pour pallier cette difficulté, un protocole automatisé de chromatographie liquide permettant l'élimination du Triton X-IOO a été mis au point. Les cinétiques de deutération des différents complexes ont alors pu être analysées dans le deuxième volet de cette étude. Les données obtenues ont permis de proposer des modèles conformationnels du transport de nucléotides au travers de la membrane interne mitochondriale, dans lesquels le transporteur présenterait une cavité ouverte tour à tour vers l'espace intermembranaire et vers la matrice. Afin d'apporter d'autres éléments de réponse sur ce mécanisme de transport et de s'affranchir de différents problèmes liés à l'utilisation des détergents, des essais de deutération du transporteur d'ADP/ATP bovin dans les mitochondries ont été entrepris et représentent le troisième volet de ces travaux. Cette approche, qui nécessite encore plusieurs améliorations, a permis d'obtenir les premières données de deutération d'une protéine membranaire dans son environnement natif. Le transporteur d'ADP/ATP est aussi impliqué dans des pathologies humaines plus ou moins grave. Dans une dernière partie, l'étude de ces mutations a été abordée en réalisant chez la levure Saccharomyces cerevisiae une étude phénotypique et biochimique de plusieurs mutants du transporteur de l'amibe Dictyostelium discoideum correspondant aux mutations humaines. Cette étude a mis en évidence un problème dans le mécanisme intrinsèque de transport, induit par la mutation V291M, qui pourrait être à l'origine de la pathologie associée.


  • Résumé

    The ADP/ATP carrier is a protein located in the inner membrane of the mitochondria. It plays a major physiological role by catalyzing the exchange of a cytoplasmic ADP against a newly synthesized A TP of the mitochondrial matrix. This protein could be inhibited very specifically by two natural poisons, the carboxyatractyloside (CATR) and the bongkrekic acid (BA), who stabilizes the protein in two distinct conformations involved in the transport mechanism. Ln order to understand this functional dynamic, a study of the ADP/ATP carrier in complex with the CATR or the BA carried out in micelles of detergent (Triton X-lOO) was realized by hydrogenldeuterium exchange coupled to a mass spectrometry analysis. This work was organized in 4 parts. The first part has consisted in an adaptation of this technique to integral membrane proteins. Indeed, the necessity of using detergent to maintain the native state of this kind of protein didn't allow using this approach to study them. To overcome this difficulty, an automatic protocol of liquid chromatography was set up and allows washing out the Triton X-lOO. Ln a second part ofthis work, exchange kinetics were analyzed. The collected data allow us to propose sorne conformational models of the nucleotide transport across the inner membrane. Ln these different models, the mitochondrial carrier would be alternatively open to the intermembrane space or to the matrix with different movements of the peptidic chain. Ln order to bring other data on this mechanism and to avoid several problems due to the detergent, sorne tries of deuteration of the bovine ADP/ATP carrier into the mitochondrial membrane were attempted. This represents the third part of this work. Even if this approach needed sorne amelioration, it provides us the first data of deuteration of a membrane protein in this native environment. The ADP/ATP carrier is also involved in severe human pathologies. Ln a last part, the study of these mutations was investigated. Several mutants of the unique ADP/ATP carrier of the amoeba Dictyostelium discoideum corresponding to human mutants was expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Analysis of the phenotype of the strains expressing mutated carriers and the measurement of the biochemical constants of these proteins have pointed out a problem in the intrinsic mechanism of transport due to the mutation V291M and could explain the associated pathology.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (188 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. 147 réf.

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  • Bibliothèque : Service interétablissements de Documentation (Saint-Martin d'Hères, Isère). Bibliothèque universitaire de Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TS09/GRE1/0320/D
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