Caractérisation fonctionnelle et structurale de la protéine trifonctionnelle (TFP) humaine, impliquée dans la beta-oxydation mitochondriale des acides gras à chaîne longue

par Benjamin Fould

Thèse de doctorat en Biochimie et biologie moléculaire

Sous la direction de Gerard Arlaud.

Soutenue en 2009

à l'Université Joseph Fourier (Grenoble) .


  • Résumé

    La l3-oxydation des acides gras est un processus cyclique essentiel du métabolisme énergétique cellulaire. (protéine trifonctionnelle) joue un rôle central dans ce mécanisme, en catalysant les 3 dernières étapes de la 13-0XYL des acides gras à longue chaîne. Ce complexe associé à la membrane interne mitochondriale est constitué de deux SL unités, a (activités énoyl-CoA hydratase et hydroxyacyl-CoA déshydrogénase) et 13 (activité 3-kétoacyl-CoA thiolase). Les données actuelles sont peu nombreuses et contradictoires, notamment concernant la stoechiométrie du TFP et l'effet inhibiteur supposé de la trimétazidine, un médicament utilisé dans les cardiopathies. La nature précise de l'association du TFP avec la membrane n'est pas connue. Le TFP humain a été obtenu sous forme recombinante chez E. Coli avec une pureté supérieure à 95%. Une caractérisation enzymatique a été réalisée, révélant des propriétés proches de celles du TFP porcin. Des mécanismes de rétrocontrôle négatif ont été mis en évidence, ainsi que l'absence d'inhibition par la trimétazidine. L'interaction du TFP avec la membrane a été analysée par co-sédimentation et résonance plasmonique de surface, démontrant une forte affinité pour la phosphatidylcholine et la cardiolipine, composants majoritaires de la membrane interne mitochondriale. Une caractérisation structurale a également été réalisée, montrant que le TFP existe majoritairement sous une forme hétéro-octamérique 04,B4. Une analyse par microscopie électronique a permis de reconstruire la structure de l'assemblage élémentaire d2{J2 et de valider le modèle 3D proposé d'après la structure cristallographique de 1 'homologue bactérien du TFP (FOM).


  • Résumé

    F atty acid l3-oxidation is a cyclic process essential for the energy metabolism of the cell. The trifunctional protein (TFP) complex plays a central role in this process, by catalysing the last 3 steps of the l3-oxidation of long-chain fatty acids. This complex is associated with the internaI mitochondrial membrane and comprises two subunits, a (harbouring the enoyl-CoA hydratase and hydroxyacyl-CoA dehydrogenase activities) and 13 (bearing the 3-ketoacyl-CoA thiolase activity). Very few data are currently available, and they are often contradictory, particularly with regard to the stoichiometry ofTFP and the putative inhibitory effect oftrimetazidine, a drug used to cure heart disorders. The precise nature of the association ofTFP with the membrane remains to be determined. Recombinant human TFP was expressed in E. Coli with a purity of over 95%. The complex was characterized enzymatically, revealing properties close to those of porcine heart TFP. Evidence for negative feedback mechanisms was obtained, and trimetazidine was shown to lack inhibitory effects. . The interaction of TFP with the membrane was analyzed by co-sedimentation and surface plasmon resonance, demonstrating strong affinity for phosphatidylcholine and cardiolipin, the major components of the inner mitochondrial membrane. Structural analyses were also performed, revealing that the major form ofTFP is a hetero-octamer 04134. Analysis by electron microscopy allowed us to reconstruct the structure of the elementary assembly d2132 and thereby to validate the model derived ITom the X-ray structure of the bacterial homologue ofTFP (FOM).

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  • Détails : 1 vol. (209 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. 116 réf.

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  • Cote : TS09/GRE1/0294/D
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