Superoxyde réductase : mécanisme de transfert d'électrons vers le site actif et rôle de la lysine 48 dans la catalyse

par Florence Bonnot

Thèse de doctorat en Chimie - Biologie

Sous la direction de Vincent Nivière.

Soutenue en 2009

à l'Université Joseph Fourier (Grenoble) .


  • Résumé

    La superoxyde réductase (SOR) est une métalloprotéine qui catalyse la réduction du radical superoxyde en peroxyde d'hydrogène. Son site actif est constitué d'un centre mononucléaire de fer pentacoordiné tout à fait particulier de type [FeHisN4CysS1]. Pour son activité catalytique, la SOR nécessite des partenaires physiologiques comme donneur d'électron (réductases cellulaires). Les SORs de Classe 1, telle que celle de Desulfoarculus baarsii, possèdent en plus du site actif, un centre de type rubrédoxine [Fe(SCys)4] qui ne réagit pas avec le superoxyde et dont la fonction est inconnue. Nous avons montré que ce centre rubrédoxine peut jouer un rôle de relais électronique entre les réductases et le site actif de la SOR. Cependant, ce transfert d'électron entre le centre rubrédoxine et le site actif ne se fait pas de façon intramoléculaire mais intermoléculaire, entre deux molécules de SOR. Nous proposons que la présence de ce centre permet à la SOR de s'adapter à une très large gamme de réductases cellulaires et optimise ainsi l'activité de détoxification du radical superoxyde de la SOR. Le mécanisme catalytique de la SOR a été très étudié par la technique de radiolyse pulsée. Nous montrons que les études antérieures sur la SOR de D. Baarsii ont été perturbées par un phénomène photochimique, résultant d'une propriété particulière d'un des intermédiaires réactionnels du cycle catalytique. Les études du mécanisme de la SOR ont été reprises en absence de cet effet photochimique et nous ont permis de proposer un nouveau mécanisme réactionnel de réduction du superoxyde par la SOR de D. Baarsii. Nos études sur le mutant SOR K48I de D. Baarsii nous ont permis de mettre en évidence le rôle essentiel que joue la lysine 48 dans la protonation de l'intermédiaire réactionnel Fe3+-hydroperoxyde. En absence de cette lysine, nous avons observé une modification profonde de la réactivité de cet intermédiaire, qui ne conduit plus à la formation du produit de la réaction H2O2. Nous avons montré que l'espèce Fe3+-hydroperoxyde formée au sein de ce mutant est alors capable de réaliser des réactions d'oxydation spécifiques, telle la transformation de thioanisole en méthyl phényl sulfoxyde. Nos données suggèrent fortement qu'en absence de cette lysine, l'intermédiaire Fe3+-hydroperoxyde évolue vers une espèce à haut degré d'oxydation de type fer-oxo, fortement oxydante, responsable de ces oxydations. Ainsi, la lysine 48 apparaît comme un résidu essentiel, qui permet pour la SOR d'orienter l'évolution de l'intermédiaire Fe3+-hydroperoxyde vers la production de H2O2, plutôt que vers la formation d'entités de type fer-oxo à haut degré d'oxydation, comme le font les oxygénases de type cytochrome P450.


  • Résumé

    Superoxide reductase (SOR) is a metalloprotein which catalyses the reduction of the radical superoxide into hydrogen peroxide. Its active site is constituted by a mononuclear iron center pentacoordinated [FeHisN4CysS1]. For its catalytic activity, SOR requires physiological partners as electron donor (cellular reductases). SORs of Class 1, such as that of Desulfoarculus baarsii, possess besides the active site, an additional iron center, rubredoxin [Fe(SCys)4] type, which does not react with the superoxide and with an unknown function. We showed that this rubredoxin center plays a role of electronic relay between reductases and the active site of the SOR. However, we show that this electron transfer between the rubredoxin center and the active site is not intramolecular but intermolecular, between two molecules of SOR. We propose that the presence of this iron center allows the SOR to adapt to various cellular reductases in order to optimize its detoxification activity. The catalytic mechanism of the SOR had been studied by pulsed radiolysis. We show that the previous studies on the SOR from D. Baarsii were perturbed by a photochemical phenomenon, resulting from a particular property of one of the key reaction intermediates of the catalytic cycle. The reaction mechanism has been reinvestigated in the absence of this photochemical effect and allowed us to propose a new reaction mechanism of reduction of the superoxide by the SOR of D. Baarsii. Our studies on the SOR mutant K48I of D. Baarsii allowed us to bring to light the essential role of that lysine 48 in the protonation of the reaction intermediate Fe3+-hydroperoxyde. In absence of this lysine, we observed a modification of the reactivity of this reaction intermediate, which does not drive any more to the formation of the product of the reaction H2O2. We showed that the species Fe3+-hydroperoxyde formed within this mutant is then capable to carry out specific reactions of oxidation, such the transformation of thioanisole methyl phenyl sulfoxyde. Our data strongly suggest that in absence of this lysine, the intermediate Fe3+-hydroperoxide evolves towards a high degree oxidation species, iron-oxo type, strongly oxidizing, responsible for these oxidations. So, the lysine 48 appears as an essential residue, which allows the SOR to direct the evolution of the intermediary Fe3+-hydroperoxyde to the production of H2O2, rather than to the formation of high-valent iron-oxo species, as observed in the cytochrome P450 oxygenases.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (250 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. 180 réf.

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  • Cote : TS09/GRE1/0227/D
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