Etudes structurales et fonctionnelles des enzymes de synthèse des galactolipides chez les plantes supérieures

par Magali Audry

Thèse de doctorat en Biologie

Sous la direction de Christelle Breton.

Soutenue en 2009

à l'Université Joseph Fourier (Grenoble) .


  • Résumé

    Les membranes plastidiales se distinguent des autres systèmes membranaires car elles sont constituées pour plus de 80% de galactolipides (le monogalactosyldiacylglycérol ou MGDG et le digalactosyldiacylglycérol ou DGDG). La MGDG synthase transfère un galactose provenant d’un UDP-Gal sur du diacylglycérol, et la DGDG synthase ajoute un second galactose provenant d’un UDP-Gal sur le MGDG. Ces enzymes sont localisées dans les membranes de l’enveloppe du chloroplaste. La présence de galactolipides semblables a été rapportée chez les pathogènes appartenant au phylum des apicomplexes et responsables d’infections humaines tels que Plasmodium falciparum agent du paludisme ou Toxoplasma gondii agent de la toxoplasmose. Ces parasites contiennent un plaste non chlorophyllien, appelé apicoplaste, acquis par endosymbiose secondaire. La synthèse de ces galactolipides est essentielle à la biogenèse des plastes non seulement chez les végétaux mais aussi chez ces parasites. Par conséquent, les enzymes de synthèse de ces galactolipides, constituent des cibles innovantes pour le développement de nouvelles molécules à action antiparasitaire contre P. Falciparum ou d’autres parasites appartenant au phylum des apicomplexes. Ces enzymes ont fait l’objet d’une étude séquence-structure-fonction. Les travaux de cette thèse ont porté sur la mise au point de protocoles d’expression et de purification des enzymes MGD1 et DGD1 d’A. Thaliana, exprimées chez la bactérie Escherichia coli, avec comme objectif majeur, la résolution de leur structure tridimensionnelle. L’obtention d’un modèle moléculaire d’atMGD1 a permis de proposer des régions d’interaction de la protéine avec les substrats et la membrane qui ont ensuite été validées par mutagenèse dirigée. L’analyse de la séquence AtDGD1 a également été initiée et les résultats obtenus se révèlent prometteurs pour envisager de modéliser cette enzyme par homologie. La recherche des séquences homologues à ces deux protéines dans le protéome de P. Falciparum a été tentée mais la méthode utilisée, basée sur la reconnaissance de repliement protéique, n’a pas donné de résultat concluant. Enfin, nous avons entrepris la modélisation moléculaire d’une sialyltransférase humaine, la hST3Gal I, car les tentatives de cristallisation sont restées infructueuses à ce jour.


  • Résumé

    Membranes from plant chloroplasts contain up to 80% galactolipids (monogalactosyldiacylglycerol or MGDG and digalactosyldiacylglycerol or DGDG). MGDG synthase transfers a galactose from UDP-Gal to diacylglycerol and DGDG synthase adds a galactose from UDP-Gal to MGDG. These enzymes are localized in the envelope membrane of plastids. The presence of similar galactolipids has been also reported in pathogens of the Apicomplexan phylum causing major human threats, such as the malarial parasite Plasmodium falciparum or Toxoplasma gondii. These parasites harbour a complex plastid (apicoplast) inherited from a secondary endosymbiotic event. Because galactolipids are unique to plastids, it has been assumed that enzymes involved in galactolipid synthesis could potentially be excellent targets for therapeutics directed against malaria and other apicomplexan-mediated diseases. These enzymes have been the subject of sequence-structure-function studies. The main achievements of this thesis were the development of protocols for expression and purification of the recombinant enzymes MGD1 and DGD1 from A. Thaliana, that were expressed into Escherichia coli. The objective was to get crystals and to solve the crystallographic structure of these enzymes. A 3D model of MGD1 was helpful to tentatively identify amino acids that could interact with the substrates and the membrane. This model was then validated through site-directed mutagenesis studies. Sequence analysis of the AtDGD1 sequence has also been initiated and the results are promising to consider homology modelling for this enzyme too. Using a fold recognition approach, the P. Falciparum proteome was searched to tentatively identify protein sequences homologous to the plant galactolipid synthases, but with no success.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (153 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. 200 réf.

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  • Bibliothèque : Service interétablissements de Documentation (Saint-Martin d'Hères, Isère). Bibliothèque universitaire de Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TS09/GRE1/0020/D
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