Caractérisation génétique et biochimique par mutagenèse dirigée et aléatoire, de répresseurs impliqués dans la réponse au stress acides phénols chez Bacillus subtilis

par Thi Kim Chi Nguyen

Thèse de doctorat en Microbiologie

Sous la direction de Jean-François Cavin.

Soutenue en 2009

à Dijon .


  • Résumé

    Ce travail a porté sur la caractérisation des mécanismes génétiques et biochimiques impliqués dans la PASR, la réponse au stress acide phénol, chez Bacillus subtilis. Cela a été réalisé grâce à des stratégies de génétique et biologie moléculaire comme la génétique inverse, la mutagenèse aléatoire par PCR ou par transposition, la délétion de gènes, la complémentation de gènes. Les éléments impliqués dans la PASR ont été identifiés, en particulier PadR, le régulateur transcriptionnel de l’expression du gène padC qui codent pour l’acide phénol décarboxlyase, élément clé de la PASR. Les séquences du promoteur du gène padC et les résidus acides aminés impliqués dans la fonctionnalité de PadR ont pu être identifiés par une stratégie mettant en œuvre, d’une part la mutagenèse dirigée du promoteur de padC, et la mutagenèse aléatoire par Error-prone PCR du gène padR, et d’autre part un criblage et une analyse fonctionnelle de ces éléments in vivo dans des souches mutantes de B. Subtilis construites pour ces objectifs. Cette analyse in vivo a été couplée à des études in vitro d’empreintes DNAseI et d’EMSA, ainsi qu’à une co-expression hétérologue chez E. Coli de ces gènes impliqués. Ce travail a également montré qu’un gène inconnu yveFG tronqué, donc supposé non-fonctionnel, co-transcrit avec padC, codait pour un peptide yveF modérateur de l’expression de padC. La réparation de ce gène yveFG et son expression chez B. Subtlis a montré qu’il codait pour un répresseur non activable du gène padC.

  • Titre traduit

    Genetic and biochemical characterization by random and site-directed mutagenesis, repressors involved in stress response phenolic acids in Bacillus subtilis


  • Résumé

    The aim of this work was to characterize the genetic and biochemical mechanisms involved in the PASR, the phenolic acid stress response induced by phenolic acids Bacillus subtilis. By genetics and molecular biology strategies, like reverse genetic, PCR or transposon random mutagenesis, gene deletion, complementation of strains, and gene expression, the main components of the PASR were identified and quantified. Site-directed and random mutagenesis of respectively the promoter of padC encoding the phenolic acid decaroxylase, and PadR, the repressor of the padC expression, allowed us to identify the site of binding of PadR with this promoter, as well as the amino-acid residues involved in the functionality of PadR. Results obtained by the use of reporter strains of B. Subtilis construct for this aim, were confirmed by in vitro foot-printing and EMSA, and heterologous co-expression of the genes in E. Coli. This work provides evidence that a supposed non-functional truncated yveFG gene, co-transcript with padC, encoded a YveF peptid which is a moderator of the padC expression, and that the repaired gene was a non-inactivable repressor of padC expression.

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Informations

  • Détails : 1 vol.(129 p.)
  • Annexes : Bibliogr. en fin de chapitres, [98] réf..

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  • Bibliothèque : Université de Bourgogne. Service commun de la documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TDDIJON/2009/61
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