Immobilisation des microsomes hépatiques, sur des membranes d'oxyde d'aluminium, pour l'étude du métabolisme de xenobiotique

par Shazia Tanvir Umar Khan

Thèse de doctorat en Biotechnologie

Sous la direction de Sylviane Pulvin.

Soutenue en 2009

à Compiègne .


  • Résumé

    Toute nouvelle entité chimique doit être scrupuleusement évaluée au niveau de la toxicité. Des efforts continuels sont entrepris afin d'améliorer les procédures de tests, de telle sorte que les estimations de toxicité puissent être effectuées plus tôt et de façon plus précise. Prédire la toxicité compte pour une large part dans l'amélioration des contrôles de sécurité, mais pour qu'il en soit ainsi, des méthodes simplifiées sont toujours exigées. Le foie par ses différentes activités enzymatiques est une source importante de risque de toxicité causée par les espèces intermédiaires famées lors du métabolisme de certains xénobiotiques, il est donc primordial d'évaluer la toxicité hépatique potentielle. Isolés du foie, les microcosmes conservent les propriétés métaboliques de cet organe responsable pour une large part, du métabolisme des drogues. Cette thèse suggère un développement rapide à moindre coût, de biocapteur pour la détection de la toxicité et du stress oxydant. Les membranes alumine poreuses sont des supports favorables pour la constitution de biocapteur, et sont également utiles pour la conception de bioréacteurs à enzymes immobilisées. Leur rapport surface/volume très élevé permet des temps de séjour courts (volume/flux de circulation) grâce au microenvironnement correspondant à un faible volume de solution réactive en contact avec un film enzymatique de grande surface. Les biocapteurs sont intéressants pour le dépistage de produits chimiques à haut risque de toxicité, dès les premières étapes de leur développement commercial, puisqu'ils peuvent être utilisés pour réduire le nombre de candidats aux bio-tests standards. Dans la première partie de cette thèse, les microsomes hépatiques du rat ont été adsorbés sur des membranes microporeuses d'oxyde d'aluminium. Par circulation au travers de la membrane alumine, les microsomes se fixent par absorption physique. Différentes activités enzymatiques du cytochrome P450, réductases et microsomes glutathion-S-transférase (mGSTI) ont été caractérisées, montrant que ce réacteur peut être utilisé pour tester le métabolisme de xénobiotiques. Les membranes avec les microsomes immobilisées peuvent être réutilisées pour tester un même ou différents substrats, après lavage à l'aide d'un tampon approprié. Un temps de stockage long (à -20°C) des microsomes immobilisés n'a pas perturbé leur activité. L'objet du deuxième partie était d'apporter des réponses à quelques questions de bases liées au fonctionnement des mGST 1 en utilisant des réactifs chimiques déjà connus, pour provoquer des stress oxydant, que ce soit directement, ou après bio-activation à travers le P450 (NADPH métabolisme dépendant). Cet aspect a fourni un aperçu pour l'utilisation du mGSTI en tant que marqueur substitutif du stress oxydant dans des applications de biosensing. Ce type de procédure permet de passer en revue les composés de molécules qui subissent une bio activation des métabolites réactives, comme il a été démontré en utilisant l'acétamophène (AP), susbstance de référence, qui mettent en exergue plus que deux volets d'augmentation de mGSTI après NADPH de métabolisme dépendant. Nous avons observé si l'adduction de glutathion a été déclenchée sachant que ce métabolite est utilisé en tant que repère pour la formation d'adduction de benzoquinone toxique (NAPQI) by LC-MSS. L'analyse HPLC de la réaction moyenne après être passée par le réacteur a présenté un pic avec le même temps de rétention comparé aux nomes. Le rapport masse charge et le modèle de fragmentation obtenu grâce à la spectrométrie de masse permet de confirmer la formation d'adductions de glutathion. Ainsi, il a aussi prouvé que la mise en évidence de mGSTI était due à la métabolisation de AP par P450. Dans la troisième partie, les microsomes ont été immobilisés sur les membranes alumines activées par des silanes. Dans le but d'obtenir une compréhension quantitative des effets de la croissance du film microsomal avec activité enzymatique, nous avons relié l'activité hydroxylase pour le parasnitrophénol (pNP) des microsomes, à la quantité de microsomes immobilisés. La membrane d'alumine a été placée dans un dispositif fluidique, avec un écoulement rapide, permettant un temps de rétention court de l'ordre de quelques secondes, et un taux de transformation du pNP en para-nitrocatéchol (pNC) suffisant pour une détection LC-MS/MS malgré une activité assez faible du CYP2E1 dans les microsomes. Les membranes d'alumine avec les microsomes immobilisés de façon covalente ont pu être utilisées à plusieurs reprises sur une période de deux mois sans perte d'activité. Le dernier chapitre de cette étude a été consacré à l'immobilisation covalente de p450 recombinant couplée à la régénération enzymatique (Glucose-6-phosphate déshydrogénase) in situ du cofacteur (NADPH). Le cytochrome CYP2E1 a été choisi pour ses propriétés métaboliques et parce qu'il est susceptible de produire de nombreuses substances réactives. De plus, in vivo le taux de CYP2EI augmente lorsque l'organisme est soumis à certaines conditions physiologiques ou pathologiques. Le CYP2E1 est un générateur important d'espèces oxygénées réactives, avec pour conséquences, stress oxydant et une toxicité. Par conséquent, la connaissance des métabolites de nouvelles drogues est toujours exigée en présence d'un taux élevé de CYP2E1. Un réacteur a été conçu avec la Glucose-6-phosphate-déshydrogénase, immobilisée sur une première membrane, permettant la régénération du NADPH utilisé pour l'activité catalytique du P450 immobilisé sur une seconde membrane. Un tel modèle peut mener au développement de diverses plateformes de réacteurs miniaturisés, pour des tests hétérogènes en cascade.

  • Titre traduit

    Immobilized hepatic microsomal membranes for xenobiotic metabolism studies using alumina membrane as a support


  • Résumé

    All new chemical entities that are produced have to be carefully evaluated in te=s of toxicity. Efforts are continuously being made to improve test procedures so that predictions of toxicity can be made earlier and more accurately. Predicting toxicity is an important part of improving safety assessment, but for this, simplified methods are always demanded. The liver is a frequent target of xenobiotic-induced toxicity and it is of great importance to assess potential hepatotoxicity. Derived from the liver, microsomes retain the metabolic properties of the liver, the organ largely responsible for drug metabolism. This thesis has addressed the development of rapid and inexpensive biosensors for chemical toxicity and oxidative stress. Porous alumina membranes are attractive materials for the construction of biosensors and also have utility for the production of immobilized enzyme bioreactors because of high surface to volume ratio, sort residence time (volume/flow rate) and microenvironment (confinement of small volume of reactive solution by huge enzymatic film). In first part of this thesis, rat heptic microsomal films were adsorbed on microporous alumina membrane by pumping through the charnels of alumina membrane where it became immobilized by physical adsorption. This biocatalytic membrane was subjected to accesse the presence of characteristic functional enzymes. Interestingly, microsomal modified supports can be re-utilized for the sme or different substrate after washing with appropriate buffer. Long te= storage (-20°C) of the immobilized microsome had not disturbed their activities. Different enzymatic activities of cytochrome P450, reductases and microsomal glutathione-S-trmsferase (mGST1) have been detected suggesting that this reactor may be useful for accessing the drag' metabolic properties. Second part was dedicated to answer some of the basic questions related to functionality of mGST1 as a sensor of toxicity in immobilized state using reactive chemical already known to induce oxidative stress either directly or after bioactivation through P450 (NADPH dependant metabolism). This aspect provided the insight for the use of mGST1 as a surrogate marker of oxidative stress in biosensing applications. This type of setup aliows screening of compounds that undergo bioactivation to reactive metabolites as being demonstrated using acetaminophen (AP) as a model drug which showed more than two fold increase in the activities of mGST1 after NADPH dependant metabolism. We exmined whether the glutathione adducts were produced, since this metabolite is used as a marker for the formation of the taxie benzoquinoneimmine (NAPQI) adduct by LC-MSS. The HPLC analysis of the reaction medium after passing through the reactor showed the peak with same retention time when compared to standard. The mass to charge ratio and fragmentation pattern obtained from mass spectrometry permit to confirm the formation of glutathione adduct by reactor. Thus, it also proved that enhanced activities of mGST1 were due to metabolism of AP by P450. In the third part of the study, microsomes were adsorbed to alumina membrane activated by silane. In an effort to gain a quantitative understanding of the effects of microsomal film growth on enzyme activity, we compared the para-nitrophenol (pNP) hydroxylase activity of the microsomes by varying the amount of microsomes fixed in alumina mieroehels. The alumina membrane was placed in a fluidic device at a fast flow which affords short residence time in seconds to get transformation of the pNP to 4-nitrocatechol (4NC) detected by LC-MSS. This enabled the use of this bioreactor where CYP2E1 activity is low and tissue sources are very limiting. The microsome has been successfully immobilized on alumina membrane and used to produce stable biocatalytic reactors that can be used repeatedly over a period of 2 months. Last part of the study was attributed for the covalent immobilization of recombinant P450 and in situ regeneration of cofactor (NADPH) by enzymatic means (Glucose-6-phosphate dehydrogenase). For this purpose Cytochrome CYP2E1 has been chosen because it metabolises and activates many substrates to more reactive products. Moreover, level of CYP2E1 is elevated under a variety of physiological and pathological conditions. CYP2E1 is an effective generator of reactive oxygen species consequently leading to oxidative stress and toxicity. Therefore the screening of new drug entries for CYP2E 1 is always demanded. Miniaturized heterogeneous membrane reactor was designed for enzyme reactions where first membrane was regenerating the cofactor and second one was utilizing it for P450 based catalysis. To simplify the technology, modified membranes were placed in a filter holder and the reaction was perfomed by loading of substrate solutions into inlet using syringe pump. Such a model system can lead to the development of various miniaturized reactor platforms for heterogeneous assays in cascade

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Informations

  • Détails : 1 vol. (143 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. 136 réf.

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  • Bibliothèque : Université de Technologie de Compiègne. Service Commun de la Documentation.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 2009 TAN 1799
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