Spéciation directe de métalloprotéines séparées sur gels d'électrophorèse : analyses XAS de la superoxyde dismutase et ICP-MS de protéines arseniées

par Sylviane Chevreux

Thèse de doctorat en Chimie analytique et environnement

Sous la direction de Richard Ortega.

Soutenue le 01-12-2009

à Bordeaux 1 .


  • Résumé

    L’analyse métalloprotéomique est un nouveau champ d’étude qui couple la détermination du protéome et l’identification, localisation et spéciation des éléments inorganiques complexés aux protéines. La faible concentration de ces hétéroéléments et la labilité possible de ceux-ci nécessite la mise en place d’outils de chimie analytique permettant une séparation des protéines à grande résolution, sans modifier la liaison protéine-hétéroélément, et une spéciation des protéines avec une technique bénéficiant d’une faible limite de détection. L’objet de cette étude est la mise en place de tels protocoles pour une application sur deux systèmes protéiques, modèles représentant les deux principales interactions métal-protéine : formation de complexes métalliques ou de liaisons covalentes. Dans une première partie, nous avons étudié la superoxyde dismutase à cuivre et zinc (CuZnSOD), protéine dont des formes mutantes sont impliquées dans une maladie neurodégénérative, la sclérose latérale amyotrophique. Les isoformes de point isoélectrique de CuZnSOD sauvage et mutante, séparées sur gel d’électrophorèse, ont été analysées par spectroscopie d’absorption des rayons X (XAS). Une analyse XAS sur des protéines séparées sur gel d’électrophorèse a ainsi pour la première fois été menée. Le traitement des spectres obtenus au seuil du Zn révèle la faisabilité de cette technique et celui au seuil du Cu met notamment en évidence des différences d’état d’oxydation Cu(I) et Cu(II) entre les isoformes. Dans une seconde partie, nous avons étudié la métabolisation de l’arsenic dans le cadre de la cancérogénicité de ce métalloïde. Les protéines extraites de cellules hépatiques exposées à l’arsenic ont été séparées par électrophorèse sur gel et chromatographie en phase liquide. L’analyse des échantillons obtenus par spectrométrie de masse a mis en évidence trois espèces protéiques complexant l’arsenic.


  • Résumé

    Metalloproteomic is a new discipline which ally proteome determination and the identification, location and speciation of inorganic elements bound to proteins. The low concentration of these heteroelements and sometimes their non-covalent binding to proteins need to set up analytical tools enabling the protein separation at high resolution, without any modification of the bond protein-heteroelement, and the protein speciation with a technique presenting a low detection limit. The aim of this study is to set up such protocols on two proteic systems, depicting the two main protein-heteroelement interactions: forming of metallic complexes or covalent bonds. First, we studied copper, zinc superoxide dismutase (CuZnSOD), mutants of this protein being involved in a neurodegenerative disease, the amyotrophic lateral sclerosis. Isoelectric point isoforms of wild-type and mutant CuZnSOD, separated on electrophoresis gel, were analyzed using X-ray Absorption Spectroscopy (XAS). XAS experiments on proteins separated on electrophoresis gel were performed for the first time. Data analysis at Zn K-edge demonstrated the feasibility of this technique and the ones at the Cu K-edge highlighted oxidation states Cu(I) et Cu(II) differences between isoforms. Second, we studied arsenic metabolisation to understand its carcinogenicity. Proteins extracted from hepatic cells exposed to arsenic were separated using gel electrophoresis and liquid chromatography. Samples analysis using mass spectrometry highlighted three proteic species which bind arsenic.


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