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Thèse soutenue

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Auteur / Autrice : Roopesh Krishnankutty
Direction : Christopher Augur, Sévastianos Roussos
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biologie des populations et écologie
Date : Soutenance en 2009
Etablissement(s) : Aix-Marseille 3

Mots clés

FR

Mots clés contrôlés

Spectrométrie de masse
Purification
Enzymes
Oxygénases
Aspergillus fumigatus
Polyphénols végétaux

Résumé

FR

L'objectif de la thèse est la purification et caractérisation fonctionnelle d'une enzyme dioxygénase impliquée dans la transformation des polyphénols des plantes. La production d'enzyme a été faite en culture en milieu solide avec Aspergillus fumigatus, un champignon filamenteux thermotolérant. L'enzyme ciblée est une dioxygénase, qui est capable de transformer les tanins condensés en particulier les procyanidines. La production de l'enzyme a été induite par l'ajout des oligomères de procyanidines dans les conditions optimales de production de cette enzyme. L'extrait enzymatique récupéré après la fermentation contenait une grande quantité de procyanidines non-transformés. On a donc mis au point une technique qui permet la précipitation sélective des polyphénols en utilisant des ampholytes tout en gardant une bonne activité enzymatique en suspension. Différentes techniques de purification (focalisation isoélectrique, échangeuse d'anions, gel de filtration) ont été appliquées afin de purifier l'enzyme en question. Cette enzyme a fait l'objet d'un séquençage peptidique, afin de déterminer sa composition en acides aminés. La forme tertiaire de dioxygénase a été modélisée en utilisant des outils bioinformatiques. L'interaction substrat-protéine a été étudiée par la méthode 'in silico' de docking moléculaire. Parallèlement, les différents produits de dégradation, issus de la réaction de l'enzyme sur un dimère particulier « Procyanidine B2 », ont été purifiés par HPLC et caractérisés moyennant la spectrométrie de masse. Ainsi, le mécanisme de reaction de l'enzyme dioxygénase a été illustré. En plus, la régio-spécificité de l'enzyme dioxygénase a été testée par l'analyse ESI-MS de différents produits, obtenus après l'action de l'enzyme sur différents modèles de procyanidines.