Dioxygénase fongique comme outils de transformation des polyphénols spécifiques de plantes - les procyanidines : une étude de cas

par Roopesh Krishnankutty

Thèse de doctorat en Biologie des populations et écologie

Sous la direction de Christopher Augur et de Sévastianos Roussos.

Soutenue en 2009

à Aix-Marseille 3 .


  • Résumé

    L'objectif de la thèse est la purification et caractérisation fonctionnelle d'une enzyme dioxygénase impliquée dans la transformation des polyphénols des plantes. La production d'enzyme a été faite en culture en milieu solide avec Aspergillus fumigatus, un champignon filamenteux thermotolérant. L'enzyme ciblée est une dioxygénase, qui est capable de transformer les tanins condensés en particulier les procyanidines. La production de l'enzyme a été induite par l'ajout des oligomères de procyanidines dans les conditions optimales de production de cette enzyme. L'extrait enzymatique récupéré après la fermentation contenait une grande quantité de procyanidines non-transformés. On a donc mis au point une technique qui permet la précipitation sélective des polyphénols en utilisant des ampholytes tout en gardant une bonne activité enzymatique en suspension. Différentes techniques de purification (focalisation isoélectrique, échangeuse d'anions, gel de filtration) ont été appliquées afin de purifier l'enzyme en question. Cette enzyme a fait l'objet d'un séquençage peptidique, afin de déterminer sa composition en acides aminés. La forme tertiaire de dioxygénase a été modélisée en utilisant des outils bioinformatiques. L'interaction substrat-protéine a été étudiée par la méthode 'in silico' de docking moléculaire. Parallèlement, les différents produits de dégradation, issus de la réaction de l'enzyme sur un dimère particulier « Procyanidine B2 », ont été purifiés par HPLC et caractérisés moyennant la spectrométrie de masse. Ainsi, le mécanisme de reaction de l'enzyme dioxygénase a été illustré. En plus, la régio-spécificité de l'enzyme dioxygénase a été testée par l'analyse ESI-MS de différents produits, obtenus après l'action de l'enzyme sur différents modèles de procyanidines.

  • Titre traduit

    Fungal dioxygenase as tools for modifying specific plant polyphenols - the procyanidins : a case study


  • Pas de résumé disponible.


  • Résumé

    The objective of thesis work was to purify the enzyme capable of modifying specific plant polyphenols and functionally characterize it for a potential application. Solid State Culturing technique was employed to produce an enzyme from Aspergillus fumigatus, a thermotolerant fungus - "the dioxygenase" capable of modifying/bio-transforming condensed tannins particularly procyanidins. The enzyme production was induced by oligomeric procyanidins purified from apple. The extracellular extract obtained after solid culturing was rich in procyanidins (non-biotransformed) and a technique was devised by us to selectively precipitate these polyphenols using ampholyte solution, at the same time retaining good amount of enzyme activity in the suspension. Different techniques such as chromatofocusing, anion-exchange chromatography coupled with FPLC, gel-filtration chromatography coupled with HPLC were used to purify the enzyme. The purified enzyme was subjected to peptide sequencing. With the peptide sequences, the three dimensional structure of the fungal dioxygenase was modeled using bioinformatics tools and also the enzyme-substrate interactions were studied \cf1 in silico] using the method of molecular docking. In parallel, the ability of the enzyme to modify procyanidins was also studied. The different products (modified/bio-transformed) obtained, after the enzymatic reaction of purified dioxygenase on the specific dimeric molecule procyanidin B2 [PB2], were purified using HPLC and characterized using electro-spray ionization mass spectrometry. Structural analysis of the different modified products from mass spectrometry resulted in elucidating the dioxygenase reaction mechanism. In addition, the regiospecificity of the dioxygenase enzyme was tested by ESI-MS analyses of the various products obtained after the enzymatic reaction of purified dioxygenase on different procyanidin model molecules.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (229 f.)
  • Annexes : Bibliogr. f. 197-218

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  • Bibliothèque : Université d'Aix-Marseille (Marseille. Saint-Jérôme). Service commun de la documentation. Bibliothèque de sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 200069633
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