Recherche de marqueurs de viabilité pour la détection moléculaire des bactéries dans l'eau

par Claire Cenciarini-Borde

Thèse de doctorat en Maladies transmissibles et pathologies tropicales

Sous la direction de Bernard La Scola.

Soutenue en 2009

à Aix Marseille 2 .


  • Résumé

    Les méthodes actuellement utilisées pour le diagnostic de pollutions bactériologiques de l'eau sont principalement des méthodes culturales. Normalisées et considérées comme fiables pendant plusieurs décennies, la pertinence de ces méthodes est remise en cause par prise en compte de l'existence de formes viables et non cultivables des bactéries, ainsi que par les situations d'urgence engendrées par les exigences croissantes des autorités sanitaires, notamment dans le domaine de la qualité de l'eau. Il est donc nécessaire de trouver des méthodes spécifiques et rapides, permettant de détecter toutes les bactéries viables, y compris les non cultivables, sans détecter les bactéries mortes. Parmi les différentes méthodes proposées dans la littérature, la recherche de marqueurs ARN de viabilité a fait l'objet de plusieurs publications concernant de nombreuses espèces bactériennes avec, pour chacune, peu et différentes cibles testées selon les études et dans des conditions expérimentales à chaque fois différentes, donnant ainsi des résultats très disparates. D'autre part, aucune étude en ce sens n'a précédé cette thèse concernant l'espèce Pseudomonas aeruginosa, qui présente pourtant un important risque sanitaire en milieu hospitalier. L'objectif de ce travail de thèse était d'apporter un éclaircissement sur ce point, à la fois en mettant en évidence des marqueurs potentiels de viabilité pour P. Aeruginosa parmi un grand nombre de cibles testées et pouvant être utilisés dans différentes conditions physiologiques, puis de comparer ces résultat avec obtenus, pour les même cibles, dans les mêmes conditions expérimentales chez Escherichia coli. Notre stratégie a été de commencer par cribler, chez P. Aeruginosa, 48 transcrits correspondant aux ARNs ribosomaux, à des "gènes cores" ou à des gènes de réponse au stress, afin de s'assurer de la présence de ces transcrits chez toutes les espèces bactériennes aquatiques. Après inactivation thermique sur des échantillons fraîchement cultivés, nous avons pu mettre en évidence 4 transcrits labiles (rplP, rplV, rplE et rpsD) et 4 transcrits persistants (ARN ribosomaux 16S et 23S, groEL et rpmE) pouvant être associés pour l'élaboration d'un test de viabilité efficace. Une légère augmentation de la stabilité des transcrits labiles a pu être observée, sans pour autant inverser la tendance générale, dans des échantillons placés 3 semaines en conditions minimum de survie dans de l'eau minérale stérile avant leur inactivation. Des expériences réalisées chez E. Coli, dans des conditions expérimentales strictement identiques, ont montré que certains de ces transcrits avaient des comportements différents, voire opposés. C'est notamment le cas des messagers groEL et rpmE qui, persistant chez P. Aeruginosa, sont apparus très labiles chez E. Coli fraîchement cultivée. Chez cette même bactérie, la mise en conditions minimum de survie durant 3 semaines entraîne de grandes modifications de la persistance de certains transcrits, notamment rplV qui, labile dans les conditions déjà citées, reste très persistant après inactivation thermique de ce type d'échantillons. Des expériences de désinfection au chlore à faible et à forte concentration nous ont également permis d'observer des différences de stabilité entre les transcrits testés, et différents niveaux de stabilité de chacun en fonction de la concentration de chlore utilisée pour l'inactivation. L'ensemble de ces résultats montre la grande difficulté de mettre en évidence des marqueurs universels de viabilité des bactéries parmi les ARNs messagers et la complexité de la disparition de ces molécules, dépendant d'une multitude de paramètres non contrôlables dans le cas du diagnostic sur les échantillons environnementaux. Afin de permettre l'approfondissement des recherches en ce sens, notamment en recherchant des marqueurs spécifiquement efficaces dans les différentes conditions envisageables, une biopuce a été façonnée pour le criblage de transcrits pour 23 espèces bactériennes aquatiques. D'autre part, l'utilisation de méthodes récemment développées, utilisant la détection d' l'ADN génomique après un pré-traitement des échantillons par du propidium monoazide a donné des résultat encourageants quant à l'avancée de la recherche de marqueurs universels de viabilité.

  • Titre traduit

    Viability markers research for molecular detection of water borne bacteria


  • Résumé

    Current methods used for the bacterial diagnosis of water are mainly cultivation methods. Standardized and considered reliable for several decades, the relevance of the method is now challenged by the known of the existence of viable and non culturable bacteria(VBNC), as well as by emergency situations caused by the increasing demands of health authorities, particularly in the field of water quality. It become necessary to develop specific and fast methods, allowing to detect all viable bacteria, including VBNC, without detecting dead bacteria. Among numerous viability assessment methods described in literature, RNA detection have been evaluated for numerous bacterial species. However, each study evaluated only few transcripts as viability markers, and in each case different targets were evaluated in different experimental conditions, rending impossible to clearly conclude about any potential viability markers. No study about Pseudomonas aeruginosa in this way has preceded this thesis work. However, this bacteria is responsible of a major health hazard in hospitals. This thesis work aimed to clarify the research of RNA viability markers by scanning numerous transcripts in consistent experimental conditions, first in P. Aeruginosa, and to highlight the most reliable targets as potential viability markers. These selected targets were then tested in changed experimental conditions and in Escherichia coli for evaluating their reliability in various situations. Our strategy consisted to begin by the scan of 48 transcripts in P. Aeruginosa, corresponding to ribosomal RNA, core genes or stress response genes. These targets were chosen to ensure about their being in all aquatic bacterial species. After heat inactivation of freshly cultivated samples, we highlighted 4 labile transcripts (rplP, rplV, rplE and rpsD) and 4 persistent transcripts (16S ans 23S rRNA, groEL and rpmE) that could be associated for developing an efficient viability test. We observed low increasing of the stability of the "labile" transcripts in samples previously stressed 3 weeks in minimum survival conditions in mineral water before heat inactivation. Nevertheless, the general tendency remained unchanged. In E. Coli, experiments realized in strictly identical conditions showed that some of these highlighted transcripts behaved differently or oppositely compared to P. Aeruginosa. For example, groEL and rpmE that were described above as persistent became labile in freshly cultivated E. Coli. Moreover, in this species, a 3 week stress in minimum survival conditions before heat inactivation caused important modifying of the general tendency, notably concerning rplV that became highly persistent in this condition. Disinfection experiments with low or high chlorine concentration showed high stability differences between the tested transcripts, and different stability levels depending on the chlorine concentrations. All these results confirmed the hardness to find universal viability markers among RNA transcripts for bacteria, and showed the complexity of their disappearance after bacterial death, depending on numerous uncontrollable parameters in environmental sample diagnosis. To enable further research in this way, including seeking specific effective viability markers in different possible conditions, a microarray has been shaped for the screening of transcripts for 23 aquatic bacterial species. Moreover, the use of recently developed methods, using genomic DNA detection after samples pre-treatment by propidium monoazide gave encouraging results regarding the progress of the research for universal viability molecular markers.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (151 f.)
  • Annexes : Bibliogr. 120 réf. Index

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  • Bibliothèque : Université d'Aix-Marseille (Marseille. Timone). Service commun de la documentation. Bibliothèque de médecine - odontologie.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : T2009/AIX2/0663Ubis
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