Inhibition de la réplication des orthopoxvirus par le phénomène d'ARN interférence : perspectives thérapeutiques

par Solenne Vigne

Thèse de doctorat en Maladies transmissibles et pathologies tropicales

Sous la direction de Jean-Marc Crance.

Soutenue en 2009

à Aix Marseille 2 .


  • Résumé

    A l’heure actuelle, face à une menace de réémergence de la variole, les recherches se sont axées vers la sélection de molécules anti-poxvirus. Dans ce contexte, les travaux réalisés au cours de cette thèse décrivent la mise en place de la technologie de l’ARN interférence comme stratégie inhibitrice de la réplication des orthopoxvirus. Nous avons évalué l’activité antivirale de plusieurs petits ARN interférents (siRNA), ayant pour cible des transcrits de gènes codant des protéines essentielles à la réplication du virus de la vaccine (VACV). A la suite de cette sélection, trois siRNA ont été retenus : siD5R- 2, ciblant le gène codant la protéine nucléoside triphosphate D5 ; siB1R-2, dirigé contre le gène B1R codant la protéine kinase B1 ; et siG7L-1, dirigé contre le gène G7L codant une protéine clé, G7, de la morphogenèse virale. Une inhibition significative de plus de 90% de la réplication virale des virus VACV, du cowpox (CPXV) et du monkeypox (MPXV), dans différentes lignées cellulaires, a été observée avec chacun de ces siRNA. Nous avons démontré que cette action antivirale est spécifique : les siRNA n’induisent pas l’activation du système interféron, et ils diminuent uniquement l’expression du transcrit ciblé (D5R, B1R ou G7L), comme démontré par RT-PCR en temps réel. De plus, le pouvoir antiviral de ces siRNA, administrés par différentes voies, a été évalué in vivo dans un modèle souris d’infection intra-nasale avec le CPXV ou le VACV. Le cidofovir (Vistide®) reste la molécule de première intention recommandée en cas de réémergence de la variole. Nous avons ainsi démontré pour la première fois qu’une association du cidofovir avec chacun des trois siRNA sélectionnés avait un effet synergique contre la propagation du VACV in vitro. De plus, l’activité antivirale des trois siRNA a étéévaluée contre cinq souches du VACV connues pour être résistantes au cidofovir, et à l’un de ses dérivés diaminopurique, HPMPDAP, du fait de la présence de mutations dans le gène codant l’ADN polymérase virale (E9L). Enfin, nous avons développé un siRNA en tant qu’outil expérimental afin d’étudier le mécanisme d’action de la molécule anti-orthopoxvirus, ST-246. Un siRNA, siF13L, dirigé contre la protéine virale F13, cible de ST-246, nous a permis de confirmer que l’activité antivirale de la molécule ST-246 était dépendante du mode de propagation de l’orthopoxvirus ciblé. Ces travaux démontrent l’efficacité des siRNA contre la réplication virale des orthopoxvirus in vitro et suggèrent de poursuivre leur développement in vivo en tant qu’outil thérapeutique ou prophylactique pour traiter les infections par poxvirus.

  • Titre traduit

    Inhibition of orthopoxvirus replication by RNA interference : therapeutic perspectives


  • Résumé

    The potential release of the etiological agent of smallpox, Variola virus, by bioterrorists, has prompted renewed interest in the development of new therapeutic molecules that inhibit poxvirus replication. Here we report the use of the RNA interference technology as a sequence-specific inhibitory approach against orthopoxvirus replication in vitro and in vivo. We have assessed the antiviral activities of several siRNAs targeting different genes that are essential for viral replication of vaccinia virus (VACV). Three siRNAs have been selected : siD5R-2, siB1R-2 and siG7L-1 designed to target, respectively, the D5R gene encoding the DNA-independant nucleoside triphosphatase, the essential viral gene B1R (i. E. , protein kinase) and the G7L gene encoding the protein G7 involved in virus morphogenesis. Each siRNA led to a significant decrease of VACV, cowpox virus (CPXV) and monkeypox virus (MPXV) replication (i. E. , up to 90%) in different cell lines. Our results have also demonstrated the specificity of the antiviral effect of each siRNA: they only knocked down the transcripts of the targeted genes, as shown by real time RT-PCR, and they did not induce any interferon response. Moreover, the antiviral potencies of these three siRNAs, following several routes of administration (i. E. , intranasal, intratracheal, intravenous or topical), have been investigated in vivo in a mouse model of orthopoxvirus infection. To date, cidofovir (Vistide®) is permitted for use as an emergency treatment in the case of smallpox outbreak. Thus, for the first time, we demonstrated the synergistic effect of cidofovir combined with each siRNA against VACV growth in cell culture. Moreover, we evaluated the antiviral potencies of these siRNAs against five vaccinia virus strains bearing mutations in the viral DNA polymerase gene (E9L), which are know to confer resistance to cidofovir and to one of its derivative, HPMPDAP. We finally developed a siRNA as an experimental tool to investigate the mechanism of action of the novel anti-orthopoxvirus compound ST-246. A siRNA (siF13L) designed to silence the F13L gene encoding the viral F13 protein, target of ST-246, confirmed our previous hypothesis: orthopoxviruses exhibit different levels of sensitivity to ST-246 due to their way of propagation. Our findings demonstrate the anti-orthopoxvirus potency of siRNAs and suggest to pursue their development in vivo as therapeutics for the treatment of poxvirus infections.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (138 f.)
  • Annexes : Bibliogr.582 réf. Index

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  • Bibliothèque : Université d'Aix-Marseille (Marseille. Timone). Service commun de la documentation. Bibliothèque de médecine - odontologie.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : T2009/AIX2/0659Ubis
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