Respiration du fer ferreux chez les microorganismes acidophiles : organisation en supercomplexe et rôle d'une protéine accessoire

par Cindy Castelle

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé. Microbiologie , biologie végétale et biotechnologie

Soutenue en 2009

à Aix-Marseille 1 , en partenariat avec Université de Provence. Section sciences (autre partenaire) .


  • Résumé

    Acidithiobacillus ferrooxidans est un organisme acidophile chimiolithotrophe qui tire son énergie de l'oxydation du fer ferreux, du soufre élémentaire et des composés inorganiques réduits du soufre en aérobiose. Ce microorganisme a un intérêt industriel car il est directement impliqué dans le processus de biolixiviation qui permet l'extraction des minerais tels que le cuivre et le cobalt. Le métabolisme énergétique est très étudié car il implique une adaptation structurale et fonctionnelle des protéines à un environnement extrême et il est à l'origine des propriétés biolixiviantes de cette bactérie. Différentes métalloprotéines impliquées dans la voie d'oxydation du fer ferreux ont été étudiées et caractérisées : le cytochrome dihémique c4 CYC 41, la rusticyanine (transporteurs solubles d'électrons localisés dans le périplasme), la cytochrome c oxydase (réductase terminale localisée dans la membrane interne) et le cyctochrome Cyc2 (localisé dans la membrane externe). Toutes ces métalloprotéines sont codées par des gènes organisés en opéron, l'opéron rus, et. . . . . Sont potentiellement impliquées dans la voie d'oxydation du fer ferreux. Des études précédentes ont montré que le cytochrome dihémique c4 CYC 41 interagit avec la rusticyanine (protéine à cuivre de type I) et la cytochrome c oxydase. Afin de rechercher si le cytochrome c4 CYC 41 sert de navette électronique entre ses deux partenaires ou si les protéines interagissent pour former un complexe, un protocole de purification couplé à des techniques de détection (protéomique, immunodétection, spectroscopie UV-Visible) a été réalisé à partir des membranes solubilisées. Ces différentes techniques nous ont permis de mettre en évidence l'existence d'une organisation supramoléculaire au niveau de la chaîne respiratoire. Ce super-complexe protéique est composé des différentes métalloprotéines codées par les gènes inclus dans l'opéron rus. La protéine Omp40 de type porine dont le rôle pourrait résider dans l'interaction de la bactérie avec le minerai est aussi identifiée. Une autre protéine de fonction inconnue codée par le gène orfl appartenant aussi à l'opéron rus a été détectée. La protéine ORF1 présente de forte similarité de structure secondaire avec les protéines appartenant à la famille des cupredoxines. Ce résultat a été confirmé par spectroscopie RPE mettant par ailleurs en évidence un signal atypique du cuivre. La purification de la cytochrome c oxydase a montré que ORF1 était systématiquement retrouvée dans ce complexe terminal. Différentes expériences réalisées pour déterminer le rôle de cette protéine au sein de l'oxydase ont révélé l'importance de ORF1 pour maintenir une activité optimale de cette enzyme particulièrement dans des conditions extrêmes de pH. Une activité qui est directement liée à la quantité de ORF1 présente dans le complexe. Par ailleurs nous avons également montré par résonance plasmonique de surface que cette protéine interagissait avec le cytochrome CYC41 favorisant ainsi le transfert d'électrons jusqu'à l'oxydase terminal. Ces différentes expériences révèlent que ORF1 pourrait jouer plusieurs rôles. En effet, on sait que la cytochrome c oxydase perd facilement son cofacteur métallique à bas pH ce qui la rend inactive. Le cuivre de ORF1 étant labile, on peut suggérer un rôle potentiel de réserve de cuivre pour l'oxydase. Nous avons donc mis en évidence l'existence d'une protéine accessoire essentielle pour préserver la fonctionnalité d'un édifice supramoléculaire. Des études cinétiques ont permis de mesurer un transfert d'électrons du fer ferreux aux cytochromes c et à la cytochrome c oxydase soulignant ainsi la fonctionnalité de cet édifice. A notre connaissance, c'est la première fois qu'un super-complexe fonctionnel regroupant des protéines membranaires (externe et interne) et périsplasmiques est mis en évidence dans un organisme acidophile. Le fer ferreux est un substrat peu énergétique, A. Ferroxidans doit donc être capable de s'adapter pour optimiser son rendement énergétique. L'intérêt d'une telle super-structure est de permettre un transfert direct des électrons du fer ferreux à l'oxygène minimisant ainsi toute perte d'énergie. Toutefois, un rôle de stabilisation des protéines ne peut être exclu.

  • Titre traduit

    Ferrous iron respiration from acidophilic microorganisms : supercomplex organization and physiological role of an accessory protein


  • Pas de résumé disponible.


  • Résumé

    Acidithiobacillus ferrooxidans is an acidophilic chemolithoautotrophic gram-negative bacterium that derives energy from the oxidation of Fe(ll) ions, elemental sulfur and various sulfur compounds at pH 2 using oxygen as electron acceptor. This organism is the main bacterium used in the industrial extraction of copper and uranium from ores using the microbial leaching technique. The study of this bacterium presents economic and fundamental biological interests. Lt oxidizes metal sulfides like pyrite, thereby enabling solubilisation and valorization of precious metals. Acidithiobacillus contains various soluble (cytochromes c4. Rusticyanin) and membrane-bound (aa3-type cytochrome c oxidase. Cytochrome Cyc2) electron carriers suspected to be involved in electron transfer from Fe(ll) ions to molecular oxygen. We have shown, after membrane solubilisation. Purification and proteomics analysis, that proteins encoded by the rus operon are associated in a macromolecular complex in this bacterium: the outer membrane-bound cytochrome c Cyc2. The periplasmlc soluble cytochrome c4 Cycl and rusticyanin, the inner membrane-bound cytochrome c oxidase and an hypothetical membrane-bound protein ORFI which function is still unknown. This complex contains also proteins from the be complex (encoded by the petI operon) and a major outer membrane protein OMP40. Sequences analysis has shown that ORFI might be a chaperon for cytochrome c oxidase maturation and Cu fixation. EPR analysis revealed that this protein probably contains Cu. The multiprotein complex is functionally active as measured by kinetics experiments using Fe(ll) ions as electron donor. This is the fnst characterization of a complex containing soluble and membranous proteins from outer and inner membrane from an acidophilic bacterium. This association in a supercomplex allows a direct electron transfer from Fe(ll) ions to cytochrome oxidase to minimize energetic losses.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (219 p.)
  • Annexes : Bibliographie p. 202-219

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