Investigation fonctionnelle et structurale des mécanismes d'activation ou de régulation de RCPGs opiacés basée sur une approche par fragments

par Bruno Vincent

Thèse de doctorat en Biologie structurale

Sous la direction de Pascal Demange et de Lionel Moulédous.

Soutenue en 2008

à Toulouse 3 .


  • Résumé

    Les récepteurs aux opiacés (MOP, DOP, KOP, NOP) sont des Récepteurs Couplés aux Protéines G (RCPG) impliqués dans les processus d'analgésie, ainsi que dans les phénomènes de tolérance et dépendance. Les mécanismes moléculaires conduisant à l'activation des récepteurs ainsi qu'à leur régulation sont encore peu compris. Une approche par fragment a été utilisée pour contourner les difficultés techniques inhérentes à l'étude des protéines membranaires. La liaison de la boucle extracellulaire 2 (EC2) du récepteur NOP avec le ligand opioïde naturel du récepteur, la nociceptine (Noc), a été étudiée par mesure d'intensité de fluorescence et spectroscopie RMN. Les résultats précisent le rôle de la boucle EC2 dans la liaison de la nociceptine et indiquent une implication de la partie message opioïde. L'extrémité C-terminale du récepteur MOP (352-398) a été surexprimée dans E. Coli et purifiée. Cet outil nous a permis de réaliser des expériences de phosphorylations in vitro par les protéines kinases A et C (PKA et PKC respectivement) suivies d'une identification par spectrométrie de masse (MS). Cette approche biochimique directe démontre que la Ser363 et la Ser375 sont deux sites de phosphorylations chacun spécifique d'une des deux kinases. La recherche des partenaires protéiques de l'extrémité C-terminale du récepteur MOP a été effectuée. Les méthodes de protéomique employées sont discutées au vu des résultats. Finalement, la caractérisation structurale par RMN en solution de cette extrémité C-terminale a permis d'établir l'existence de deux domaines structurés en hélice a ouvrant des perspectives d'études d'interactions protéine-protéine.

  • Titre traduit

    Structural and functional investigation of GPCR fragments to study activation and regulation mechanisms


  • Résumé

    The opiate receptors (MOP, DOP, KOP, NOP) belong to the G Protein Coupled Receptor (RCPG). They are implicated in the effects of analgesia and tolerance and all dependent phenomena associated with. The molecular mechanisms for their activation signal transduction and regulation are still under investigation. During my thesis, an approach by fragment was used to pass through the difficulties lie on the intrinsic properties of the membrane proteins. The extracellular loop 2 (EC2) plays a crucial role for the specificity of recognition with its ligand the Nociceptin. Using mimicking peptidic fragments, the interaction of EC2- Nociceptin was studied by fluorescence and NMR spectroscopy. The results obtained allow us to specify the interaction between ligand and extracellular loop and prove the importance of the message part of the Nociceptin. The C-terminal part of the GPCR is implicated in the regulation phenomena that occur during the physiological process. The C-terminal peptide of MOP receptor (352-398) was expressed in E. Coli and purified. MOP fragments in fusion with the GST were used for GST or Histidines pulldown experiments to find new partner proteins. Biochemical studies of this peptidic fragment allowed us to identify two phosphorylation sites (Ser363 and Ser375), respectively specific of both PKC and PKA. Moreover, structural biology made essentially by NMR spectroscopy showed us two alpha helices domains surrounding crucial phosphorylation sites.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (XX-181 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. XX-167-XX-181

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  • Bibliothèque : Université Paul Sabatier. Bibliothèque universitaire de sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 2008TOU30251
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