Ligand identification screen for an orphan GPCR with enriched expression in the central extended amygdala

par Clara Blad

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Brigitte L. Kieffer.

    mots clés mots clés


  • Résumé

    GPR88 est un récepteur orphelin couplé aux protéines G exprimé dans le striatum. Dans notre laboratoire, nous avons montré que l'ARNm du récepteur est enrichi dans l'amygdale centrale étendue (EAc) chez la souris (Becker et al. 2008) et qu'il y a une augmentation de l'ARNm de GPR88 dans cette structure après un traitement chronique à la morphine. L'EAc est impliquée dans la régulation des effets émotionels et des propriétés renforçantes des drogues d'abus. Ces résultats suggèrent que GPR88 joue un rôle dans la dépendence aux drogues. Pour cette raison un projet a été lancé pour indentifier un agoniste pour ce récepteur, en collaboration avec AstraZeneca R&D Montréal. Le couplage préférentiel de GPR88 étant inconnu, nous avons construit des lignées cellulaires de HEK293 co-exprimant GPR88 humain avec des protéines Gq adaptatrices (Gqis et Grn) couplés à la voie calcique. Puis, nous avons criblé une chimiothèque de 4130 composés pour leur capacité à activer GPR88 en utilisant un essai calcique. La chimiothèque a également été criblée pour des dépolarisations membranaires induites par GPR88, en utilisant un indicateur fluorescent sensible aux modifications du potentiel de membrane. Dans ces cribles, 48 composés ont induit une augmentation de la concentration de calcium intracellulaire, alors que 77 composés ont initié une dépolarisation membranaire. Nous avons réalisé des expériences de validation avec ces composés qui nous ont permis de sélectionner quatre composés induisant une libération de calcium à 1 μM. Ce sont la papaverine, le mométasone furoate (deux molécules de petite taille), le peptide ASDFRTVCNNVIPKSIPDI et le peptide Beta-12 (glycoprotéine lla (296-306)). Des expériences de dose-réponse ont été réalisées mais seul le mométasone furoate a induit des faibles réponses calciques. Pour les autres composés les résultats du crible n'ont pas été confirmés. A l'avenir nous criblerons des chimiothèques plus larges et aborderons la fonction de GPR88 in vivo par des approches knockout.


  • Résumé

    GPR88 is an orphan G protein-coupled receptor expressed in the striatum. Ln our laboratory we showed that the receptor mRNA is also enriched in the central extended amygdala (EAc) (Becker at al. 2008) and that GPR88 mRNA is upregulated in this structure after chronic morphine treatment in mice. The EAc is known to be important for the emotional effects and reinforcing properties of drugs of abuse. These results suggest that GPR88 plays arole in drug addiction. Therefore we started a program to identify an agonist for this receptor, in collaboration with AstraZeneca R&D Montréal. As the G protein coupling of GPR88 is unknown, we first constructed HEK293 cell lines co-expressing human GPR88 with adapter Gq proteins (Gqis and G16) coupled to the calcium pathway. We then screened a library of 4130 compounds for activation of GPR88, using a calcium assay. We also screened the compound library for GPR88-mediated membrane depolarization using a voltagesensitive dye assay. Ln these screens 48 compounds induced an increase in intracellular calcium levels whereas 77 compounds caused membrane depolarization. We performed validation experiments with these compounds which enabled us to select four compounds that provoked calcium mobilization at 1 μM. These include papaverine, mometasone furoate (both small molecules), peptide ASDFRTVCNNVIPKSIPDI and peptide Beta- 12 (glycoprotein lla (296-306)). Dose-response experiments were performed with these compounds but only mometasone furoate provoked small calcium responses. For the other compounds the results of the screen were not confirmed. Ln the future larger libraries will be screened and GPR88 function will be studied using knockout approaches.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (179 f.)
  • Notes : Publication autorisee par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p.114-121. Annexes

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  • Bibliothèque :
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : H 503.000,2008;3248
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