Approches transcriptomiques in vitro de l’hépatotoxicité des xénobiotiques : optimisation des conditions expérimentales et étude comparée des effets de différents composés

par Carine Lambert

Thèse de doctorat en Biologie

Soutenue en 2008

à Rennes 1 .


  • Résumé

    La toxicogénomique consiste à analyser les profils transcriptomiques de milliers de gènes à un instant donné. Discipline récente, elle vise à la fois à évaluer le potentiel toxique de nouveaux médicaments et à identifier les mécanismes moléculaires impliqués. Le type de toxicité d’origine médicamenteuse principalement rencontré chez l’homme est l’hépatotoxicité du fait de la place privilégiée qu’occupe le foie dans le métabolisme des médicaments. Aussi, notre étude a consisté, dans un premier temps, à valider l’approche transcriptomique pour des études d’hépatotoxicité in vitro en utilisant les cellules HepaRG, seule lignée hépatique humaine ayant conservé une capacité de biotransformation oxydative des xénobiotiques. Ces cellules ont été traitées avec une concentration élevée de phénobarbital (8mM, PB) en utilisant diverses conditions expérimentales. La comparaison des profils d’expression génique obtenus à partir de différentes plateformes, différentes générations de puces à ADN et différentes conditions de culture a permis d’identifier 1099 gènes modulés dans les six expériences réalisées, démontrant la reproductibilité et la robustesse de la technologie utilisée. Une stratégie d’analyse des données d’expression a ainsi été proposée. Une étude des effets du PB, en fonction de la concentration et du temps de traitement des cellules HepaRG, a ensuite confirmé les données de la littérature obtenues à partir d’hépatocytes humains, à savoir une modulation de l’expression de nombreux gènes induits comme ABCB1, ALAS1, CYP2A6, CYP2B6, CYP3A4, SULT2A1 ou réprimés tels que SULT1B1 et SULT1E1. L’analyse fonctionnelle des gènes (IPA™) a montré que la plupart d’entre eux interviennent dans le métabolisme des xénobiotiques et des lipides (FABP4, CYP4A11, CYP7A1, CYP8B1). De nouveaux gènes modulés par le PB ont également été identifiés (CYP24A1, CYP4F3). Enfin, une troisième étude a montré que le nombre de gènes exprimés constitutivement dans les cellules HepaRG est supérieur à celui des hépatocytes humains (14766 vs 11826 sur les 20232 gènes présents sur la puce). Nous avons également comparé les effets du PB (1 et 3. 2mM) à ceux de la troglitazone (TRO, 5 et 20 µM) et de l’aflatoxine B1 (AFB1, 0. 05 et 0. 25 µM) sur des cellules HepaRG ainsi que sur des pools d’hépatocytes humains. Des gènes modulés significativement et statistiquement spécifiques de chaque molécule ont ainsi été identifiés (p. Ex. FHIT pour l’AFB1, KIAA1881 et MBL2 pour la TRO), et sont, pour la plupart, les mêmes dans les deux modèles cellulaires. En conclusion, notre étude démontre la faisabilité de l’approche transcriptomique in vitro et l’intérêt d’utiliser les cellules HepaRG pour les études d’hépatotoxicité prédictive et mécanistique de xénobiotiques.

  • Titre traduit

    In vitro transcriptomic approaches of xenobiotic hepatoxicity : experimental optimization and comparative effects of various chimicals


  • Résumé

    Application of the genomics technologies in toxicology (i. E. Toxicogenomics), consists in analysis of gene expression profiling in response to toxic substances in a given cell type or tissue. These technologies allow to predict adverse effects of pharmaceuticals and other chemicals and to elucidate their mechanism of action. Because of the central role of the liver in biotransformation and clearance of chemicals, hepatotoxicity is the main chemical-induced damage in humans. Our first objective was to validate the transcriptomic approach for investigating xenobiotic metabolism and toxicity in vitro using the well-differentiated human hepatoma HepaRG cells which represent the only hepatic cell line expressing the major cytochromes P450. Cells were exposed to a high concentration (8 mM) of phenobarbital (PB) in order to obtain marked effects through various experimental conditions. Comparisons of gene expression profiles from different culture conditions, platforms and generations of microarrays enabled to identify 1099 genes modulated in six independent experiments, thereby demonstrating the reproducibility, feasibility and robustness of microarray technologies in vitro. The second objective was to study concentration- and time-dependent PB effects. The results confirmed previous data from human hepatocytes in primary culture. Indeed the same genes were found either overexpressed (ABCB1, ALAS1, CYP2A6, CYP2B6, CYP3A4 and SULT2A1) or repressed (SULT1B1 and SULT1E1). A functional analysis (IPA™) indicated that most genes were implicated in xenobiotic and lipid metabolism activities (e. G. FABP4, CYP4A11, CYP7A1 and CYP2B8). New PB-modulated genes were also identified (CYP24A1, CYP4F3). The third objective was to compare the transcriptome and the effects of three hepatotoxic compounds: PB, troglitazone (TRO) and aflatoxin B1 (AFB1), in HepaRG cells and human hepatocytes using one-color microarrays. Analyses showed that the number of constitutive genes expressed in HepaRG cells was greater than in human hepatocytes (14 766 versus 11 826 out of 20 232 genes present on microarrays). Likewise, statistically specific genes of each chemical were characterized and some of them were similarly regulated in the two cell models (e. G. FHIT for AFB1, KIAA1881 and MBL2 for TRO). Moreover, a good concordance was observed in PB-induced expression profiles in both HepaRG cells and human hepatocytes by comparing one- and two-color microarrays. In conclusion, our work demonstrates the feasibility of in vitro transcriptomic approaches and the suitability of HepaRG cells for predictive and mechanistic hepatotoxicity studies.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (153 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f. 145-153

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  • Bibliothèque : Université de Rennes I. Service commun de la documentation. Section sciences et philosophie.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TA RENNES 2008/185
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