Révélation des interactions spécifiques des membres de la famille des TRX et leurs cibles potentielles, par la technique de la double hybride

par Mohamed Ragab Abdel Gawwad

Thèse de doctorat en Science de la vie

Sous la direction de Yves Meyer.

Soutenue en 2008

à Perpignan , dans le cadre de École doctorale Énergie environnement (Perpignan) .


  • Résumé

    TRXs are small proteins (≈ 12 kDa) with a redox active disulfide bridge present in the characteristic active site CxxC (Schürmann and Jacquot, 2000). It was found that this active site is conserved in many other TRXs from different organisms and was considered as a special signature for TRX. The structural motif of TRX is composed of 4 alpha helices surrounding 5 beta strands. TRXs have been found in both prokaryotes and eukaryotes and the sequence around the redox-active disulphide bond seems to be highly conserved. A number of eukaryotic proteins contain domains evolutionary related to thioredoxin, many of them are part of the protein disulphide isomerase (PDI) family. In their reduced form they constitute very efficient protein disulfide oxido-reductases. The number of TRX genes in non-photosynthetic organisms is relatively limited if it compared to that of photosynthetic organisms. Genes encoding TRXs with a CXXC or CXXS active site and large proteins containing at least one TRX domain (TRX-like proteins) are considered, 42 genes can be identified in the genome of Arabidopsis thaliana. The considerable progress in the identification of new TRX targets has completely changed this situation and suggests that TRXs could constitute central regulators of cell metabolism in several subcellular compartments. Despite the use of different TRX isoforms known to exhibit distinct preferences for TRX targets, no specificity has been observed biochemical approaches. In this work, we have used CY306 Y2H a new tool in which the two endogene TRX are deleted to bring the specificity between TRXs and their targets. We have studied both classical redox system; TRXf/FBPase and TRXm/MDH. In this work, we used an approach of Yeast-two hybrid: some thioredoxins interact with their targets in a stable way by interactions of electrostatic or absorbent loads hydrophobic. These interactions can be highlighted in a system commercial yeast two hybrid. For the majority of the TRX the interaction is too fugacious and can be highlighted only by stabilizing the intermediate complex which associates the TRX and its target by a bridge disulfide. In a commercial Y2H the complex doubles is destroyed by the endogenous TRX and no signal is observed. We used the stock cy306 (yeast strain stock in which endogenous TRX were inactivated) and we thus could show target interactions TRX. One studied two systems strain redox chloroplastic TRXf/FBpase and TRXm/MDH as well as the interactions between certain cytosolic TRX h and a cytosolic MDH. The results obtained show that this approach doubles hybrid reveals better than the test of activity or proteomic the specificity of interaction of the TRX for their targets.

  • Titre traduit

    Revelation of specific interactions of the family members of TRX and their potential targets, by the technique of yeast two-hybrid


  • Résumé

    Les thiorédoxines (TRX) sont de petites protéines (≈ 12kDa) avec un pont disulfure actif redox actuel dans le site actif caractéristique CxxC (Schürmann et Jacquot, 2000). Ce site actif est conservé dans beaucoup d'autre TRXs de différents organismes et est considéré comme signature desTRX. Le motif structural de TRX se compose de 4 hélices alpha entourant 5 feuillets bêta. Les TRXs ont été trouvés chez les procaryotes et les eucaryotes, la région autour du site active est fortement conservée. Un certain nombre de protéines escarotiques contiennent des domaines TRX conservés au cours de l'évolution, bon nombre d'entre elles font partie de la famille de protéines isomérase disulfide (PDI). Sous leur forme réduite elles constituent des oxydoréductases très efficaces de protéine disulfide. Le nombre de gènes de TRX dans les organismes non-photosynthetiques est relativement limité si on le compare à celui des organismes photosynthétiques. 42 gènes codant pour les TRXs avec un site actif CXXC ou CXXS et de grandes protéines contenant au moins un domaine de TRX (TRX-like protéines) ont été identifiés dans le génome d'Arabidopsis thaliana. Les progrès considérables dans l'identification de nouvelles cibles de TRX ont complètement changé cette situation suggérant que les TRX constituent des régulateurs centraux du métabolisme des cellules en plusieurs compartiments sous-cellulaires. En dépit de l'utilisation de différents isoforms de TRX connus pour rechercher des préférences parmi les cibles des TRX, aucune spécificité n'a été montrée en utilisant les approches biochimiques. Dans ce travail, on a utilisé une approche d'interaction par double hybride à l'aide de deux systèmes: certaines thioredoxines interagissent avec leurs cibles de manière stable par interactions de charges électrostatiques ou hydrophiles hydrophobes. Ces interactions peuvent être mises en évidence dans un système double hybride commercial. Pour la plupart des TRX l'interaction est trop fugace et ne peut être mise en évidence qu'en stabilisant le complexe intermédiaire qui associe la TRX et sa cible par un pont disulfure. Dans une levure double hybride commerciale le complexe est détruit par les TRX endogènes et aucun signal n'est observé. Nous avons utilisé la souche cy306 (souche de levure rapporteur dont les TRX endogènes ont été inactivées) et nous avons pu ainsi démontrer des interactions TRX cibles. On a étudié deux systèmes redox classiques chloroplastique TRXf/FBpase et TRXm/MDH ainsi que les interactions entre certaines TRX h cytosoliques et une MDH cytosolique. Les résultats obtenus montrent que cette approche double hybride révèle mieux que les test d'activité ou la protéomique la spécificité d'interaction des TRX pour leurs cibles.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (92 f.)
  • Annexes : Bibliogr. f. 74-92

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  • Bibliothèque : Université Perpignan Via Domitia. Service commun de la documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TH 2008 ABD
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