Rôle de la lysyl-ARNt synthétase mitochondriale humaine dans la réplication du VIH-1Caractérisation de l'inhibition d'un nouveau mutant de la GTPase Arf

par Sebastian Flisiak

Thèse de doctorat en Sciences biologiques. Ingénierie des protéines

Sous la direction de Marc Mirande, Mahel Zeghouf et de Jacqueline Cherfils.


  • Résumé

    Rôle de la lysyl-ARNt synthétase mitochondriale humaine dans la réplication du VIH-1. La transcriptase inverse codée par le génome du VIH-1 utilise l’ARNt3Lys de la cellule-hôte pour amorcer la transcription inverse de son génome ARN en ADN proviral. Il existe trois isoformes de la lysyl-ARNt synthétase humaine (LysRS), toutes les trois codées par le même gène : les formes cytoplasmique (cLysRS), mitochondriale (mLysRS) et pré-mitochondriale (pmLysRS). L'espèce pmLysRS est le précurseur de mLysRS qui est clivé après import dans la mitochondrie. Il a été montré au laboratoire que la LysRS mitochondriale est sélectivement encapsidée dans les particules du VIH-1 et pourrait donc être responsable du transport des ARNtLys au cours du processus d’encapsidation. Au cours de ce travail, nous avons exprimé, purifié, et analysé les capacités de ces trois formes enzymatiques à former un complexe avec l'ARNt. Les résultats décrits dans ce mémoire montrent que les formes mLysRS et pmLysRS purifiées ont la capacité d'aminoacyler l’ARNtLys aussi bien que la forme cytoplasmique de l'enzyme. Nous avons recherché quelles protéines virales pourraient s'associer à la LysRS et à l'ARNtLys pour former le complexe d'encapsidation de l'ARNtLys,3. Par le système du double-hybride, nous avons montré que la protéine Gag n’interagit avec aucune des trois formes de LysRS. Mais nous avons observé que toutes les isoformes de LysRS interagissent avec Pol, un précurseur polyprotéique de HIV-1. Ces données montrent que mLysRS/pmLysRS pourrait former le complexe d'encapsidation de l'ARNt par interaction avec GagPol, et servirait à transporter l'ARNtLys,3. Nos resultats suggèrent aussi qu'un autre facteur est impliqué dans la formation d'un complexe spécifique entre Pol et mLysRS ou pmLysRS pour l’encapsidation de l'ARNt dans las particules virales. Caractérisation de l’inhibition d’un nouveau mutant de la GTPase Arf. Les petites protéines G de la famille Arf sont des régulateurs majeurs du trafic cellulaire chez les eukaryotes. Il a été montré récemment que les protéines Arf sont impliquées dans des cancers ou bien des maladies infectieuses lorsqu'elles sont dérégulées. Les Arfs sont activées par l’échange GDP/GTP, échange stimulé par leurs facteurs d'échange nucléotidique (GEFs). Les GEFs sont donc de bons candidats pour bloquer spécifiquement les voies de signalisation correspondantes. Le premier inhibiteur de GEF connu a été le macrolide fongique bréfeldine A (BFA). Son mécanisme d’inhibition a été appelé inhibition interfaciale et constitue un concept prometteur pour la découverte de nouveaux inhibiteurs. Grâce à ce concept, la petite molécule inhibitrice LM11 a été découverte par criblage in silico en utilisant la structure cristallographique du complexe Arf1-GDP/ARNO qui a été précédemment résolue dans notre laboratoire. La fixation de LM11 dans la cavité criblée a été précédemment analysée par des mutations d’ARNO et par RMN HSQC d’Arf1-GDP. Dans ce travail, j’ai étudié la contribution de Lys38 dans Arf1, résidu dont le déplacement chimique est affecté en RMN HSQC par la présence de l’inhibiteur LM11. J’ai utilisé la mutagenèse dirigée pour construire un nouveau mutant d’Arf1, Arf1K38A. Ce mutant a été exprimé, purifié et analysé pour son activité d’échange et sa sensibilité à l’inhibiteur. On a montré que le résidu K38 d’Arf1 est crucial pour le mécanisme d’inhibition de LM11, mais reste sensible à la BFA. Dans la deuxième partie de mon travail, j’ai construit, exprimé et purifié la forme entière d’Arf4, un membre de la classe II des Arfs, dont les propriétés biochimiques sont mal caractérisées.

  • Titre traduit

    Mitochondrial isoform of human LysRs and its role in HIV-1 replication. Characterisation of an Art mutant with differential responses to GEF inhibitors


  • Résumé

    Mitochondrial isoform of human LysRS and its role in HIV-1 replication. The HIV-1 reverse transcriptase (RT) uses the host cellular tRNALys,3 as a primer for reverse transcription of the viral genomic RNA into dsDNA. Human lysyl-tRNA synthetase (LysRS) occurs in three isoforms coded by one gene: the cytoplasmic (cLysRS), mitochondrial (mLysRS) and premitochondrial (pmLysRS) forms of LysRS. PmLysRS is the precursor of mLysRS targeted to the mitochondria. LysRS is hijacked with tRNALys,3 into the HIV-1 viral particles. In our group, we showed that mitochondrial LysRS, but not its cytoplasmic counterpart, is found in the viral particles. In order to further investigate the role of mLysRS and also of pmLysRS in reverse transcription of the RNA genome of HIV-1, we expressed, purified and studied the kinetic parameters for all human LysRS isoforms in order to assess their tRNA-binding capacities. We observed that not only cLysRS but also both mLysRS and pmLysRS could efficiently aminoacylate tRNALys,3. We searched for viral proteins that could associate with LysRS and tRNALys to form the tRNA-packaging complex. Using the two-hybrid system, we identified that all three isoforms of LysRS are able to interact with Pol, a polyprotein precursor of HIV-1, but not with Gag protein as was reported previously. These data suggest that mLysRS/pmLysRS could form the tRNA-packaging complex with GagPol protein and serve as a carrier of tRNALys,3. In addition, our data suggest that it might exist additional factors required to produce a specific tRNA-packaging complex between Pol and mLysRS or pmLysRS. Characterisation of an Arf mutant with differential responses to GEF inhibitors. The small GTP-binding protein Arf is a major regulator of cellular traffic in eukaryotes. It has recently been shown to be deregulated in several human diseases, including cancer and infections. Arf proteins are activated by GDP/GTP exchange, which is stimulated by their guanine nucleotide exchange factors (GEFs). GEFs are therefore attractive candidates to interrupt specifically the corresponding signalling pathways. The fungal macrolide brefeldin A (BFA) was the first known GEF inhibitor. Its inhibition mechanism was called the interfacial inhibition and became a promising way for drug discovery. A small molecule inhibitor called LM11 was subsequently discovered by in silico screening using the crystal structure of the Arf1-GDP/ARNO complex previously solved in the laboratory. The binding site of the inhibitor to the target pocket was previously analyzed by mutations in ARNO and by NMR HSQC of Arf1-GDP. In this work, we further investigated the contribution of Lys38 in Arf1, which was shown by NMR to be affected by the binding of the inhibitor. I used site-directed mutagenesis to construct a novel mutant of Arf1, Arf1K38A. The mutant protein was then expressed, purified to homogeneity and analyzed for its exchange properties and sensitivity to inhibitors. We find that the K38 residue of the Arf1 is crucial for LM11 inhibition mechanism, but remains sensitive to BFA. In a second part of this work, I constructed, expressed and purified full-length form of Arf4, a member of the Arf family whose biochemical properties are poorly characterized.

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  • Détails : 1 vol. (204 p.)
  • Annexes : Comprend des références bibliographiques

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 0g ORSAY(2008)155
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