Flavocytochrome b2 : réactivité avec l’oxygène moléculaire et utilisation d’un réactif suicide comme sonde mécanistique

par Abdoul Kader Ould Boubacar

Thèse de doctorat en Chimie bio-organique

Sous la direction de Jean-Pierre Mahy et de Florence Lederer.

Soutenue en 2008

à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des Sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .


  • Résumé

    Le flavocytochrome b2 (Fcb2) oxyde physiologiquement le L-lactate en pyruvate chez S. Cerevisiae. C’est une flavodéshydrogénase/transférase d’électrons homotétramérique. Chaque sous-unité est composée d’un domaine à hème et d’un domaine flavodéshydrogénase (FDH). C’est la FDH qui appartient à la famille des L-α-hydroxyacides déshydrogénases à FMN. Les enzymes de cette famille ont un repliement commun en tonneau α8ß8, une forte conservation des résidus du site actif et semblent partager le même mécanisme de réduction du FMN. Pour ces enzymes, la plupart des arguments mécanistiques et structuraux plaident pour un mécanisme par carbanion mais certains ne permettent pas d’exclure un mécanisme par transfert d’hydrure. La famille comprend à la fois des oxydases et des transférases d’électrons que rien des structures 3D ne permet de distinguer. Ce travail avait pour but d’apporter un ou des argument(s) supplémentaire(s) en faveur d’un mécanisme par carbanion. Nous avons pu montrer que le cyclopropylglycolate (analogue cyclopropylé le plus simple du L-lactate) est un substrat suicide du Fcb2 dans des conditions particulières (en présence de O2 comme seul accepteur d’électrons) avec formation de 2 adduits covalents, isomères, du FMN avec le réactif suicide, ce qui ne saurait pas être expliqué par un mécanisme par transfert d’hydrure dans la réaction normale. Nous avons constaté que la FDH n’est pas inactivée dans les mêmes conditions, ce qui nous a poussés à tout d’abord étudier la réactivité de la flavine, aussi bien dans la FDH que dans le Fcb2, avec l’oxygène moléculaire. Les significations mécanistiques concernant tous ces résultats sont discutées dans ce manuscrit.

  • Titre traduit

    Flavocytochrome b2 : reactivity with molecular oxygen and utilisation of a suicid reagent as a mechanism-based inactivator


  • Pas de résumé disponible.


  • Résumé

    The flavohemoprotein Flavocytochrome b2 (Fcb2) catalyses the oxidation of L-lactate to pyruvate in the yeast mitochondrial intermembrane space. It is a homotetrameric dehydrogenase - electron transferase. Each sub-unit is composed of a heme-binding domain and a FMN-binding domain (FDH). This is the FDH who belongs to the family of FMN-dependent L-2-hydroxy acid-oxidizing enzymes. The enzymes of this family have a common fold (α8ß8 barrel) a strong conservation of the active site residues and seem to share the same mechanism for substrate dehydrogenation. For these enzymes, most mechanistic and structural arguments support the idea that the substrate dehydrogenation reaction proceeds by initial formation of a carbanion but some can not exclude a mechanism by hydride transfer. The family includes both dehydrogenases-oxidases and dehydrogenases-electron transferases. Nothing in 3D structures can distinguish oxidases from electron transferases. This work was intended to bring an (or many) additional argument (s) for a carbanion mechanism. We were able to show that the cyclopropylglycolate (the simplest cyclopropyl analog of L-lactate) is a suicide substrate of Fcb2 under specific conditions (in the presence of O2 as the only electron acceptor) with formation of 2 isomeric covalent adducts of FMN with the suicide reagent, which cannot be explained by a mechanism by hydride transfer in the normal reaction. The FDH recombinant domain is not inactivated in the same conditions, which led us to first study the reactivity of the flavin, both in the FDH in the Fcb2, with molecular oxygen. The mechanistic meanings on all these results are discussed in this manuscript.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (151 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 134-151. Index

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 0g ORSAY(2008)118
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