Elaboration de couches ultra-minces électroactives pour la transduction directe de l'hybridation d'oligonucléotides

par Grégory March

Thèse de doctorat en Surfaces, interfaces, réactivité, adhésion

Sous la direction de Minh Chau Pham.

Soutenue en 2008

à Paris 7 .


  • Résumé

    Ce travail de thèse a consisté à élaborer des biocapteurs à ADN permettant de réaliser une détection électrochimique directe de l'hybridation ne nécessitant ni marquage de l' ADN ni ajout de réactifs. Ces dispositifs, basés sur une approche originale, utilisent une sonde rédox immobilisée sensible à son environnement physico-chimique : la Juglone (5-hydroxy-l,4-naphthoquinone) ou JUG comme transducteur électrochimique. Dans une première approche, nous avons réalisé des monocouches auto-assemblées à base d'un dérivé thiolé de la Juglone (3-butanedithiol-5-hydroxy-l,4-naphtoquinone) ou , JUGthio. Ce système s'est révélé extrêmement sélectif (discrimination demésappariement unique) et sensible (= 300 pM). De plus, les systèmes obtenus présentent une détection de type signal-on, c'est à dire une augmentation du signal lors de l'hybridation. Pour comprendre le mécanisme de transduction, nous avons ensuite analysé la cinétique de transfert électronique en utilisant le formalisme du transfert de charges couplé au transfert de protons. En utilisant l'approximation de Butler-Volmer, nous avons montré que la cinétique rédox est déterminée par une étape qui n'engage pas de transfert électronique pour des pH supérieurs à 7. La possibilité qu'a la JUGthio réduite de créer des liaisons hydrogènes à des pH supérieurs à 7 et le fait que ces liaisons doivent être rompues lors de la réoxydation semblent constituer l'étape limitante de la réaction rédox. Ainsi, la transduction directe pourrait être obtenue grâce au changement de conformation de l'ADN lors du passage de simple brin au duplex. En effet, le grand degré de liberté du simple brin permet d'envisager de fortes interactions hydrogène avec la JUGthio. En présence du brin complémentaire, ces interactions disparaissent au profit de la formation du duplex d'ADN, modifiant de facto la cinétique de transfert de charges du transducteur (JUGthio). La seconde partie de mon travail a été de développer des couches ultra-minces, obtenues par électroréduction d'un sel de diazonium, toujours à base de dérivés de Juglone et d'acide 4-amino-benzoïque, afin de construire une nouvelle interface biosensible pour la détection de l'hybridation d'ADN. Ce système s'est révélé efficace pour la détection de l'hybridation d'oligonucléotides puisque les premiers essais montrent qu'il permet de discriminer une cible complémentaire d'une cible aléatoire et qu'il présente une détection de type signal-on. Enfin, des essais préliminaires de transfert de ces systèmes vers la réalisation d'immuno-capteurs (ovalbumine/anti-ovalbumine) ont été réalisés.

  • Titre traduit

    Electroactive ultra-thin layers for direct transduction of DNA hybridization


  • Résumé

    My Phd works consist in developing DNA biosensors that allow direct (reagentless and label-free) electrochemical detection of hybridization. We have developed an original approach based on the use of immobilized redox probes, very sensitive to their physicochemical environment : Juglone derivatives as electrochemical transducers. First, we have realised self-assembled monolayer based on a Juglone thiol derivative. This System is very selective (single polymorphism segregation) and sensitive (~ 300 pM). Moreover these Systems show a signal-on detection that is to say an increase of signal after hybridization. To understand the transduction mechanism, the electron transfer kinetic was also analysed under the scope of coupled electron and proton transfer formalism. Using the Butler- Volmer approximation, we show that the redox kinetic is determined by a non-electronic step for pH above 7. The possibility of the reduced JUGthio to create hydrogen bounds at pH above 7 and the fact that these hydrogen bounds have to be disrupted during the reoxidation seem to play a critical role in the rate limiting step. So, direct transduction could be obtained thanks to the conformationnal change occurring during hybridization with the transformation of DNA from single strand to double strands. Indeed, with the high degree of freedom of the single strand, strong hydrogen interactions between single stranded DNA and JUGthio could be considered. After complementary target addition, these interactions disappear due to the formation of the double stranded DNA and the charge transfer kinetic of the transducer JUGthio is modified. Then, we were concerned with ultra-thin mixed films of Juglone derivatives and 4- aminobenzoic acid, obtained by electrochemical reduction of the corresponding diazonium salts, to build a new biosensitive interface for DNA detection. This System is efficient in the way that it can discriminate complementary and random targets. It also presents a signal-on detection. Last part of my work deals with the transposition of this method of transduction to the detection of other bio-analytes, especially with the realisation of immunosensors (ovalbumin/anti-ovalbumin).

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Informations

  • Détails : 1 vol. (164 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : 167 réf.

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université Paris Diderot - Paris 7. Service commun de la documentation. Bibliothèque Universitaire des Grands Moulins.
  • PEB soumis à condition
  • Cote : TS (2008) 237
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