Le substrat de ERK IEX-1 est un inhibiteur général des phosphatases PP2A de la famille B56 impliqué dans la signalisation TPO

par Géraldine Boy-Rocher

Thèse de doctorat en Bases fondamentales de l'oncogénèse

Sous la direction de Françoise Porteu.

Soutenue en 2008

à Paris 7 .


  • Résumé

    La voie ERK joue un rôle important dans les fonctions de la TPO. L'équipe avait isolé le gène précoce IEX-1 en tant que substrat de ERK en réponse à la TPO et démontré une régulation réciproque des activités de ces deux protéines : IEX-1 phosphorylée par ERK acquiert une fonction anti-apoptotique ; IEX-1 en liant ERK, maintien son activation. Ce denier effet est du à la capacité de IEX-1 d'inhiber de façon spécifique la famille des phosphatases PP2A contenant les sous-unités régulatrices B56 (PP2A-B56). IEX-1 inhibe PP2A-B56 en permettant la phosphorylation de la sous-unité B56 par ERK ce qui conduit à la dissociation de la sous-unité catalytique de l'enzyme. Ces résultats suggéraient que IEX-1 pourrait séquestrer les sous-unités B56 de PP2A, les empêchant d'agir sur d'autres substrats. En effet, nous avons observé que IEX-1 bloque la déphosphorylation d'Akt sur Ser473 et Thr308 et augmente son activité kinase. Akt est une cible des PP2A-B56. En effet, la surexpression de sous-unités B56 entraîne une diminution de la phosphorylation d'Akt sur Ser4723 et Thr308. L'effet inverse est retrouvé en utilisant les siRNA dirigés contre B56β et γ. Les PP2A-B56 reversent l'effet de IEX-1 sur Akt. En utilisant des mutants dominant-négatifs de ERK et des mutants de phosphorylation de B56, nous avons montré que l'effet de IEX-1 sur Akt est dépendant de la phosphorylation de B56 par ERK. IEX-1 maintien donc l'activation d'Akt et de ERK par le même mécanisme. Ces résultats montrent que IEX-1 agit comme un inhibiteur cellulaire général des PP2A-B56et identifient un nouveau substrat des PP2A-B56 ainsi qu'une nouvelle coopération entre les voies ERK et Akt. Dans les cellules UT7-Mpl, IEX-1 est induit spécifiquement par la TPO, mais pas par l'EPO ou le GM-CSF, et participe au maintien de l'activation de ERK et Akt en réponse à cette cytokine. IEX-1 est aussi exprimée dans les CSH CD34+CD38- puis au cours de la différenciation des mégacaryocytes. Le nombre et la taille des CFC ainsi que la fréquence des LTC-IC sont augmentés lorsque IEX-1 est surexprimée par infection lentivirale dans les cellules CD34+ de sang de cordon ombilical. Des résultats préliminaires montrent que la surexpression de IEX-1 pourrait compenser de façon spécifique l'absence de TPO pour la prolifération des cellules CD34+. Par contre, la surexpression de IEX-1 n'a pas d'effet sur la différenciation mégacaryocytaire. Ces résultats suggèrent que IEX-1 et la famille des PP2A-B56 pourraient jouer un rôle unique dans les capacités de la TPO à maintenir le compartiment des CSH.

  • Titre traduit

    The ERK substrate IEX-1 is a general inhibitor of the B56-containing PP2A phosphatases involved in TPO signaling


  • Résumé

    IEX-1 is an early-response gene involved in survival and proliferation, which is rapidly induced by growth factors, viral infections or chemical carcinogens. IEX-1 was previously isolated as a substrate of the kinase ERK and having a dual role in ERK signaling : IEX-1 acquires anti-apoptotic functions upon phosphorylation by ERK and by binding to active ERK, IEX-1 behaves as a positive regulator of ERK activation, prolonging ERK signal in response to various growth factors. We have elucidated the mechanism by which IEX-1 prolong ERK signal. The major Ser/Thr phosphatase involve in ERK activation is the protein phosphatase 2A (PP2A). It is made of three subunits: the structural (A), the regulatory (B) and the catalytic (C) subunit. IEX-1 binds specifically to the B56 regulatory subunits of PP2A. This association enhances B56 phosphorylation by ERK and trigger dissociation from the catalytic subunit leading to the inactivation of the PP2A. We examine whether IEX-1 could control only the dephosphorylation of associated ERK or have a more general effect on other kinase activities controlled by PP2A. By using IEX-1 surexpression and shRNA targetting IEX-1, we found that IEX-1 had no effect on the phosphorylation of MEK, p38 or JNK, but that it encreased and sustained the activation of the kinase Akt by preventing its dephosphorylation both on in residues the308 and ser473. These similar regulations of Akt and ERK activities by IEX-1 prompted us to examine whether the same mechanism operates on the two pathways. Overexpression of IEX-1 and B regulatory subunit together shows that specifically B56 subunit strongly reduced the capacity of IEX-1 to prolong Akt phosphorylation. This indicates that Akt phosphorylation is controlled by PP2A holoenzyme containing B56 subunits. Next we have explored the mechanism by which IEX-1 prevents the activity of B56 on pAkt. To test that, we use an IEX-1 protein mutated in its ERK binding site, loosing its ability to both bind pERK and to inhibit B56-PP2A activity. This mutant was enable to extained the duration of pAKT signal showing that IEX-1 mediated Akt activation is dependent on its capacity to bind ERK. To confirm this result, we expressed IEX-1 together with ERK1 and ERK2 kinase dead mutant, devoided of catalytic activity. Expression of this mutant reduces the capacity to protect Akt from inactivation. This result indicate that the ability of IEX-1 to encreased ERK mediated phosphorylation of B56 subunit provides a general mechanism leading to inhibition of B56 regulatory subunits containing PP2A enzymes function. IEX-1-mediated ERK-dependent inhibition of B56 containing is responsible for its ability to control both ERK and Akt activation.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (180 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : 150 réf.

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  • Bibliothèque : Université Paris Diderot - Paris 7. Service commun de la documentation. Bibliothèque Universitaire des Grands Moulins.
  • PEB soumis à condition
  • Cote : TS (2008) 003
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