Etude du rôle de la protéine TAT1/SLFC26A8 dans la lignée germinale mâle et de son implication dans les asthénozoospermies humaines

par Pierre Lhuillier

Thèse de doctorat en Biochimie. Biologie moléculaire et cellulaire

Sous la direction de Gérard Gacon.

Soutenue en 2008

à Paris 5 .


  • Résumé

    La protéine TAT1/SLC26A8 a été isolée dans le laboratoire comme une cible des GTPases Rho, exclusivement exprimée dans le testicule humain adulte. Elle appartient à la famille des protéines de transport SLC26 et l'équipe a précédemment montré sa localisation à la membrane plasmique des cellules germinales mâles aux stades spermatocyte et spermatide, ainsi que son activité vis-à-vis des anions sulfate et chlorure. Durant ma thèse, j'ai caractérisé un modèle d'inactivation du gène Tatl chez la souris (Knock ouf) et mis en évidence l'importance de la protéine Tatl pour la différenciation et la mobilité des spermatozoïdes. Ainsi, les souris mâles Tat1-/- sont stériles suite à une asthénozoospermie sévère et des défauts structuraux des spermatozoïdes. Les spermatozoïdes Tat1-/- présentent une atrophie de l'annulus, structure en forme d'anneau située à la jonction des pièces intermédiaire (PI) et principale (PP) du flagelle, une disjonction PI/PP, une plicature du flagelle et une cassure de l'axonème; par ailleurs les spermatozoïdes TaT1-/- présentent une absence d'hyperphosphorylation en conditions capacitantes. En accord avec ce phénotype, nous avons montré que chez l'homme comme chez la souris, la protéine TAT1 est également exprimée dans le spermatozoïde mature où elle se localise à l'annulus. De manière à tester l'implication de la protéine TAT1 dans les infertilités masculines humaines, nous avons réalisé des immunodétections de la protéine TAT1 sur des frottis de spermatozoïdes de sujets asthénozoospermiques. Le criblage d'une cohorte de 75 sujets a permis d'isoler un patient présentant une asthénozoospermie modérée associée à une absence de marquage TAXI à l'annulus. Par microscopie électronique à transmission, nous avons observé l'absence complète de l'annulus et une disjonction PI/PP. Ces résultats inédits suggèrent que chez l'homme comme chez la souris, l'intégrité de l'annulus conditionne la mobilité et la différenciation flagellaire des spermatozoïdes. Finalement, afin de déterminer si le rôle de la protéine Tatl dans le contrôle de la mobilité du spermatozoïde fait intervenir son activité de transport anionique, j'ai crée deux mutants ponctuels de la protéine TAT1 (D95N et G218V); ces mutations précédemment décrites dans la littérature abolissent l'activité de transport des protéines SLC26 mais préservent leur adressage à la membrane plasmique. In vitro, y ai vérifié que les mutants TAT1 D95N et TAT1 G218V présentent une expression quantitativement normale et un adressage correct à la membrane plasmique des cellules COS. Si comme attendu, ces mutations induisent, in vitro, une perte de l'activité de transport d'anions, elles seront introduites (de manière indépendante) dans le gène Tatl murin pour la création de modèles d'étude de type « Knock in ».

  • Titre traduit

    Study of TAT1/SLC26A8 protein in male germ cell and implication in human asthenozoospermia


  • Résumé

    We have previously identified TAT1/SLC26A8 as a potential target of Rho GTPases, exclusively expressed in human adult testis. TAT1 is a member of the SLC26 family and we have shown that TAT1 is located at the plasma membrane of germ cells at spermatocyte/spermatid stages and exhibits a transport activity towards sulfate and chloride anions. During my thesis, I characterized the phenotype of mice with a targeted disruption of Tat gene (knock out) and showed that Tatl protein is essential for sperm flagella differentiation and motility. Hence, Tat1-/- males are sterile due to severe asthenozoospermia and structural defects of the spermatozoa. Tatr spermatozoa display an atrophia of the annulus (the ring shape structure connecting the midpiece to the principal piece), a midpiece-principal piece disjunction and hairpin-like bending of the flagella leading to the disruption of the axonemal structure. In addition, we observed that Tat1-/- spermatozoa do not display the phosphorylation profile required for sperm capacitation. According to this phenotype, we showed that TAT1 is also expressed in mature sperm where it is specifically localized at the annulus. In order to investigate the implication of TAT1 in human asthenozoospermia, we performed imunodetection of TAT1 on sperm smear preparations from a cohort of 75 asthenozoospermic subjects. We identified one patient with a moderate asthenozoospermia associated with the absence of TAT1 staining at the annulus. By transmission electron miscroscopy, we observed complete lack of the annulus and midpiece-principal piece disjunction in spermatozoa from the patient. This case, so far unique, suggests that in human the integrity of the annulus is also required for proper sperm motility and flagella differentiation. Finally, in order to address the role of TAT1 anion transport activity in the control of sperm motility and capacitation, I generated two mutants (D95N and G218V) in TAT1 sequence, based on published data concerning mutations in SLC26 proteins that abolish transport activity without affecting plasma membrane localization. I analyzed these mutants, in vitro, and showed normal expression level and proper localization of the proteins at plasma membrane of COS cells. If, as we expect, these mutations inhibit TAT1 transport activity in vitro, we will proceed to their introduction into the murine Tatl gene in order to generate « knock in » mouse models.

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  • Détails : 1 vol. (156 f.)
  • Annexes : Bibliogr. f. 146-156

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