Immunogénicité de la préproinsuline dans le diabète de type 1 humain chez un modèle murin humanisé HLA

par Taghrid Hammoud Laika

Thèse de doctorat en Endocrinologie, Immunologie

Sous la direction de Christian Boitard.

Soutenue en 2008

à Paris 5 .


  • Résumé

    Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune résultant de la destruction spécifique des cellules bêta insulino-sécrétrices des îlots+de Langerhans et survenant sur un terrain génétique de prédisposition. Les principales cellules impliquées sont les lymphocytes T CD4 et TCD8+. Une lignée de souris transgéniques pour la molécule de classe I HLA A2. 1 et la molécule de classe II DQ8 d'une part et invalidées pour les molécules endogènes du CMH murin, d'autre part, a été créée au laboratoire. Ce modèle permet l'étude pré-clinique des réponses T CD8 et CD4 restreintes par les molécules du CMH humain impliquées dans le diabète de type 1 contre la préproinsuline humaine. Dans un premier temps, la validation phénotypique et fonctionnelle de ces souris transgéniques a été réalisée, ce qui m'a permis de prendre ce modèle pour cette étude. Les premiers résultats ont permis de caractériser quatre épitopes restreints à HLA-A2. 1 dans la séquence signal de la préproinsuline humaine, par immunisation individuelle contre une banque de peptides couvrant cette région. La réponse T-CD8 ex vivo a ensuite été étudiée par un test de cytotoxicité sur des cellules RMA-S transfectées par HLA-A201, ainsi que sur des cellules P815 transfectées par HLA-A201 et le gène de la préproinsuline humaine. Des clones et des lignées T CD8 ont ainsi été obtenus pour chaque peptide caractérisé, lesquels ont été validés par un test de cytotoxicité. La seconde partie de ce travail repose sur l'immunisation individuelle de ces souris par des peptides synthétiques couvrant toute la séquence de la préproinsuline humaine pour l'étude de la réponse T CD4 ex vivo par un test de prolifération. Cela a permis de définir quatre épitopes de la préproinsuline humaine présentés par la molécule HLA-DQ8. Ces résultats ont été confirmés par immunisation avec un pool de 4 épitopes caractérisés et donnant des résultats identiques à ceux obtenus par l'immunisation contre les peptides individuels. Afin de confirmer l'apprêtage et la présentation naturelle de ces épitopes par la molécule HLA-DQ8. La protéine recombinante de la préproinsuline a été produite par le système bacculovirus. L'immunisation par cette protéine a permis de montrer que le peptide 20-35 peut être comme l'épitope le plus immunogène caractérisé et que cette souris transgénique HLA-A2. 1/HLA-DQ8 a la capacité de développer une réponse T CD4 HLA-DQ8 restreinte contre cet épitope, qu'il soit administré sous forme synthétique ou native. L'ensemble de ces données permet donc de valider l'utilisation de ce modèle de souris humanisée comme modèle préclinique pour le développement d'approche visant la définition des autoantigènes humains associés au diabète de type 1

  • Titre traduit

    Immimogenecity of the preproinsulin human in type 1 diabetes and in mice transgenic HLA


  • Résumé

    Type 1 diabetes involves the activation of lymphocytes against p cell autoantigens. In animal models, the predominant role of T lymphocytes is supported by experiments in which diabetes is transferred into naive recipients by diabetogenic T cells, is prevented by antibodies that interfere with T lymphocyte activation or fails to develop in diabetes-prone mice in which key genes in T lymphocyte differentiation or activation are non functional. In man, T lymphocytes are predominant within insulitis at early stages of diabetes. Occurrence of diabetes in an immuno-deficient patient deprived of B lymphocytes further underscores the role of T lymphocytes in human diabetes. MHC class II-restricted CD4+ T cells are central in the autoimmune diabetes process but CDS* T cells play a pivotal role in its initiation in NOD mice. In the human, CD8+ T cells are predominant in the islet cell infiltrate of acutely diabetic patients in most observations. Recurrent diabetes in recipients of isografts from a discordant twin is accompanied by predominant CD8+ T cell infiltration. Among p cell autoantigens, proinsulin has been ascribed a key role in diabetes. In man, insulin and proinsulin are common targets of autoantibodies and T cells in diabetic and prediabetic individuals. Anti-insulin antibodies (IAA) are the first to be detected in children at risk for diabetes and carry a high positive predictive value for diabetes in siblings of type 1 diabetic patients. In NOD mice, injection of insulin-specific T cell clones accelerate diabetes. Protection from diabetes is obtained by injecting insulin in prediabetic mice. In addition, proinsulin 1"'" or 2"'" NOD mice show delayed or accelerated diabetes, respectively. We and others have obtained evidence that a restricted region of human proinsulin located in the B chain and adjacent C-peptide clusters proteasotne cleavage sites generating correct C-termini of putative MHC class 1 peptides and a high number of epitopes that are recognized by diabetic CDS* T cells. Other epitopes have been located within the A chain. Recognition of epitopes that are located within the C peptide and C peptide-B chain junction including residues that are excised during the insulin secretion process makes a strong case for proinsulin as an autoantigen in diabetes. However, there has been no study of epitopes located within the preproinsulin leader sequence despite strong evidence that leader sequence peptides can be presented by class I HLA molecules, especially HLA-A2. 1. To characterize class I-restricted epitopes within the preproinsulin leader sequence, we selected 8- to 11-mer peptides carrying anchoring residues for class I molecules. These peptides were studied for binding to common class I molecules and for carrying C-terminal residues generated by proteasome digestion. HLA-A2-restricted peptides were further tested for immunogenicity in HLA-A*0201 transgenic mice. Peptides were studied for recognition by PBMCs from diabetic patients. To study the natural processing of preproinsulin leader peptide, mouse CD8+ T cell clones specific to HLA-A*0201 -restricted peptides were tested for cytotoxicity against PS 15 cells transfected with the HHD and preproinsulin genes.

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  • Détails : 1 vol. (202 f.)
  • Annexes : Bibliogr. f. 177-202

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