Etudes de l'interaction RasGAP/CAPNS1 et développement d'inhibiteurs du domaine SH3 de RasGAP

par Perayot Pamonsinlapatham

Thèse de doctorat en Sciences du médicament

Sous la direction de Françoise Raynaud.

Soutenue en 2008

à Paris Descartes .


  • Résumé

    Indépendamment de son activité GEF (guanine exchange factor) désactivant Ras sous forme GDP, RasGAP agit comme un effecteur de Ras majeur dans les cellules tumorales impliquant de nouvelles voies de signalisation. Une approche innovante, pour valider l’inhibition d’interactions moléculaires de la protéine cible RasGAP a été la sélection d’aptamères peptidiques, que nous avons développés contre son domaine SH3 comme cible. Nous avons utilisé une approche combinatoire d’aptamère peptidique pour sélectionner une collection de ligands peptidiques spécifiques du domaine SH3 de RasGAP. Nous avons cartographié les sites de liaison de l’aptamère peptidique en présence d’un ensemble de mutation SH3-RasGAP en système de levure double hybride (AptaPrint). Nous avons étudié l’effet biologique d’un aptamère RG 27 qui cible une poche délimitée par les résidus D295/7, L313 et W317. Cet aptamère a un effet anti-prolifératif et anti-apoptotique qui n’est pas dépendant des caspases sur les cellules tumorales. Il inhibe l’interaction RasGAP et Aurora B. Dans la deuxième partie, nous avons décrit une nouvelle cible du domaine SH3 de RasGAP et étudié son interaction avec la petite sous unité commune des calpaïnes ubiquitaires Capns1. Cette petite sous-unité est un partenaire du domaine SH3 de RasGAP. L’interaction entre RasGAP et Capns1 est mise en évidence par coimmunoprécipitation et RasGAP pull-down et par microscopie confocale. Nous avons précisément étudié la migration de cellules PC3 (Raswt) et PC3-RasV12, qui expriment de façon stable la mutation de Ras oncogénique et la plus fréquemment retrouvée dans les cancers humains. Le complexe SH3-RasGAP/Capns1 est retrouvé augmenté d’un facteur 2 dans les protrusions des cellules C3-RasV12 par rapport celles des cellules PC3. En perturbant ce complexe par RNA interférence RasGAP, la migration cellulaire et l’apoptose des cellules exprimant la mutation RasV12 sont toutes deux perturbées, ce qui indique que RasGAP agit comme effecteur de Ras.

  • Titre traduit

    Studies of interaction RasGAP/CAPNS1 and development ihibitior of domain SH3 of RasGAP


  • Résumé

    Regardless of its activity as guanine exchange factor (GEF), Ras disabling form GDP, RasGAP acts as a major effector of Ras in tumor cells involving new signaling pathways. The innovative approach to validate the inhibition of molecular interactions of the protein RasGAP is the selection of peptidic aptamers, which we have developed against its SH3 domain. We used a combinatorial approach of the peptide aptamer to select a collection of specific peptides against the RasGAP-SH3 domain. We have mapped the binding sites of aptamer in the presence of a SH3-RasGAP mutation system in yeast double hybrid (AptaPrint). We studied the biological effect of the RG 27 aptamer, which target a pocket bounded by residues D295/7, L313 and W317. This aptamer has anti-proliferative and anti-apoptotic effect which is not dependent on caspases in tumor cells. RG27 inhibits the RasGAP and Aurora B interactions. In the second part, we described SH3 domain of RasGAP as a new target and studied its interaction with the small common subunit ubiquitous calpains (Capns1). This small sub-unit is a partner in the SH3 domain of RasGAP. The interaction between RasGAP and Capns1 is highlighted by co-immunoprecipitation and RasGAP pull-down and confocal microscopy. We have precisely studied the migration of PC3 cells (Raswt) and PC3-RasV12, which expresses a stable oncogenic Ras that is mostly found in human cancers. The SH3-RasGAP/Capns1 complex is found increased by a factor of 2 in cells PC3-RasV12 protrusions in contrast to parental PC3. In this complex, siRNA RasGAP disrupts cell migration and apoptosis RasV12 harboring cells, indicating that RasGAP acts as effector of Ras.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (142 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 130-135

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  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire de santé (Paris). Pôle pharmacie, biologie et cosmétologie.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TPHB 10508
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