Etude du système ars bactérien de résistance à l'arsenic : diversité des transporteurs d'arsénite et analyse moléculaire d'un opéron ars

par Asma Achour-Rokbani

Thèse de doctorat en Biologie

Sous la direction de Pascale Bauda.

Soutenue en 2008

à Metz .


  • Résumé

    L’arsenic est un métalloïde largement répandu dans l’environnement. Il se trouve essentiellement sous deux formes toxiques : l’arséniate [As(V)] et l’arsénite [As(III)]. De nombreux microorganismes sont capables de transformer l’arsenic (par oxydation, réduction et méthylation) et sont ainsi directement impliqués dans le cycle biogéochimique de ce métalloïde. Parmi les mécanismes de transformation de l’arsenic, le système ars semble largement répandu parmi les bactéries. Il consiste à transformer As(V) en As(III) (qui est la forme la plus toxique et la plus mobile de l’arsenic), puis à expulser ce dernier à l’extérieur de la cellule sous l’action d’un transporteur d’arsénite membranaire. Deux familles de transporteurs d’arsénite ont été décrites chez les procaryotes : la famille ArsB (la plus étudiée) et la famille Acr3p, elle même subdivisée en deux groupes. Dans le cadre de ce travail nous avons défini trois jeux d’amorces dégénérées permettant l’amplification des gènes arsB et ACR3. Ces amorces ont été utilisées pour la détection des gènes arsB/ACR3 de quarante et un isolats bactériens résistants à l’arsenic isolés à partir de deux sols lorrains présentant des concentrations différentes en arsenic. Les résultats PCR ont montré que 70,7 % des isolats contiennent un gène de transporteur d’arsénite avec une prévalence du génotype ACR3 par rapport à arsB. Ces résultats ont ainsi validé l’utilisation de nos amorces pour la détection des gènes de transporteurs d’arsénite. En plus de la validation des amorces, nous avons largement caractérisé la collection de quarante et un isolats bactériens résistants à l’arsenic : identification moléculaire, détermination des CMIs à As(III), As(V) et Sb(III) et recherche des activités arsénite oxydase et arséniate réductase. Parmi ces quarante et une souches, deux présentent une activité arsénite oxydase et trente-neuf une activité arséniate réductase. L’isolat A33 Microbacterium sp. S’est distingué par son niveau de résistance particulièrement élevé à As(III) et As(V). Nous avons identifié par une approche moléculaire, le système ars de cette souche. Notre analyse a révélé un système original composé de 6 gènes arsT, arsX, ACR3(1), arsRC2, arsC1 et arsC3 qui codent respectivement une thiorédoxine réductase, une thiorédoxine, un transporteur d’arsénite, une protéine de fusion "régulateur-arséniate réductase", une arséniate réductase et une autre arséniate réductase. Les cinq premiers gènes font partie d’un même opéron et arsC3 est transcrit dans une direction opposée. Bien que la thiorédoxine réductase et la thiorédoxine soient connues pour être indispensables au fonctionnement de certaines ArsC thiorédoxine dépendantes, les gènes arsT et arsX font rarement partie des opérons ars connus. De même ArsRC2 est une protéine atypique rarement trouvé dans les opérons ars connus. Une autre particularité de l’opéron ars de Microbacterium sp. Est la protéine ArsC3 qui contient le motif "CX5R" spécifique des ArsC thiorédoxine dépendantes mais ne contient pas les deux résidus cystéines localisés du coté C-terminal de ces dernières et indispensables pour la réduction d’As(V) en As(III). Une stratégie est proposée pour analyser le rôle de chaque gène de l’opéron ars de Microbacterium sp. Dans la résistance à As(III) et As(V).

  • Titre traduit

    A study of bacterial arsenic resistance system (ars) : diversity of the transporters and molecular analysis of an ars open


  • Résumé

    Arsenic is an ubiquitous toxic metalloid. The two most common forms of arsenic in the environment are inorganic arsenate [As(V)] and arsenite [As(III)]. Many microorganisms are able to transform arsenic (by oxidation, reduction and methylation) and thus play an important role in the biogeochemical cycle of this metalloid. Among the mechanisms of arsenic transformation, the ars system seems to be widely distributed in bacteria. This detoxification system involves the reduction of As(V) in As(III) (the most toxic and most mobile form) which is then pumped out of the cell through an integral membrane transporter. Two unrelated families of arsenite transporters have been described in prokaryotes: the well-characterized ArsB family and the Acr3p family which is subdivided into two subgroups. In this study, we designed three sets of degenerate primers allowing the amplification of the arsB and ACR3 genes. These primers were used to screen a collection of forty-one arsenic-resistant strains isolated from two soil samples from Lorraine with contrasting levels of arsenic concentration. PCR results showed that 70. 7 % of the isolates contained a gene related to arsB or ACR3 family. The ACR3 genotype was predominant over arsB. These results validated the use of our primers for the identification of arsenite transporter genes. In addition to validating the primers, we characterised a novel collection of forty-one arsenic-resistant strains: molecular identification, MIC determination for As(III), As(V) and Sb(III) and detection of arsenite oxidase and arsenate reductase activities. Among these forty-one strains, arsenite oxidase activity was detected in two strains and arsenate reductase activity in thirty-nine. The Microbacterium sp. A33 isolate showed high resistance level to both As(III) and As(V). We used a molecular approach to identify arsenic resistance (ars) genes of this strain. Our analysis revealed an original system composed of 6 genes : arsT, arsX, ACR3(1), arsRC2, arsC1 et arsC3 that encode a thioredoxin reductase, a thioredoxin, an arsenite transporter, a fusion protein "regulator-arsenate reductase", an arsenate reductase and another arsenate reductase respectively. The first five genes belong to the same operon and arsC3 gene is transcribed in the opposite direction. Thioredoxin and thioredoxin reductase are essential to thioredoxin-coupled arsenate reductase activity. However, the majority of ars operons don’t encode these proteins. The atypical protein ArsRC2 is also rarely present in ars operon. The ArsC3 arsenate reductase is another particularity of Microbacterium sp. Ars system. ArsC3 contains the CX5R specific motif of thioredoxin-coupled arsenate reductases but don’t contains in the C-terminal extremity the two cysteine residues essential for reduction of As(III) to As(V). A strategy is proposed to analyze the role of each Microbacterium sp. Ars gene in resistance to As (III) and As(V).

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