Isolement et caractérisation de trois gènes codant une lipase et deux estérases hypothétiques chez la microalgue marine Isochrysis galbana (Prymnesiophyceae, Haptophyta)

par Stéphanie Godet

Thèse de doctorat en Biophysiologie des organismes et des populations

Sous la direction de Françoise Ergan.

Soutenue en 2008

à Le Mans .


  • Résumé

    Connues pour leur forte teneur en acides gras polyinsaturés ω3, certaines espèces de microalgues suscitent actuellement l’intérêt des chercheurs et des industriels. Les enzymes lipolytiques, qui sont impliquées dans la mobilisation et le stockage des acides gras, n’ont pas encore été caractérisées d’un point de vue structural et fonctionnel chez les algues. Ce mémoire décrit l’isolement, l’analyse et le clonage de 3 gènes codant une lipase et deux estérases hypothétiques chez la microalgue marine Isochrysis galbana. L���analyse des marqueurs de séquences exprimées, édités dans la banque EST d’Isochrysis galbana, a révélé l’existence de gènes incomplets susceptibles de coder des enzymes lipolytiques. Après extraction des ARN totaux, purification et rétrotranscription des ARN poly(A)+, 3 ADNc pleine-longueur ont été obtenus par amplification rapide de leurs extrémités 5’ et 3’. L’analyse des séquences nucléotidiques a révélé la présence de 3 phases ouvertes de lecture codant 3 protéines de poids moléculaires théoriques équivalents à 49,06 kDa, 26,92 kDa et 24,88 kDa. Les études d’alignement de séquences ont montré des similitudes avec des lipases et des estérases d’organismes bactériens, fongiques, végétaux et animaux. Bien que de faibles taux d’identité (20 à 30 %) aient été observés, les 3 séquences contiennent la triade catalytique Ser/Asp/His et le pentapeptide consensus Gly-X-Ser-X-Gly, 2 motifs hautement conservés chez les enzymes de la superfamille des hydrolases à repliement α/β. Pour confirmer la fonction lipolytique des protéines hypothétiques, une démarche expérimentale a été initiée : les gènes ont été clonés dans un vecteur d’expression de levure.

  • Titre traduit

    Isolation and characterisation of three genes encoding one putative lipase and two putative esterases from the marine microalga Isochrysis galbana (Prymnesiophyceae, Haptophyta)


  • Résumé

    Known for their high ω3 fatty acids contents, some microalgal species are currently receiving much attention from scientific and industrials. Lipolytic enzymes from microalgae involved in fatty acids mobilisation and storage have not been structurally and functionally characterised. This work describes isolation, analyses and cloning of 3 complete gene encoding one putative lipase and two putative esterases from the marine microalga Isochrysis galbana. The EST database of Isochrysis galbana was searched for cDNA sequences showing homology with lipolytic enzymes. Among the candidates genes identified, none of them was found to be full-length. Total RNA extraction, poly(A)+ RNA purification, reverse transcription, rapid amplifications of both 5’- and 3’- cDNA ends and nested PCR were performed to obtain 3 complete coding sequences. Nucleotide sequence analyses revealed 3 open reading frames encoding 3 proteins with a predicted molecular weight of approximately 49,06 kDa, 26,92 kDa and 24,88 kDa. Databases were searched for a global function expertise and results revealed similarities with lipases and esterases from various organisms such as bacteria, fungi, plants and animals. Although those three putative proteins shared low levels of amino acids identity (from 20 to 30 %), they all enclosed two highly conserved patterns, the catalytic triad Ser/Asp/His and the consensus pentapeptide Gly-X-Ser-X-Gly, found in enzymes of the α/β hydrolases superfamily. To confirm the predicted lipolytic function, an experimental procedure was introduced: genes were cloned in a yeast expression vector.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (235 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 221-235

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  • Bibliothèque : Université du Maine. Service commun de documentation. Section Sciences.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : 2008LEMA1014
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  • Cote : 2008LEMA1014
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