Etudes structurales et fonctionnelles de la protéine ALIX

par Ricardo Pires

Thèse de doctorat en Biologie structurale et nanobiologie

Sous la direction de Winfried Weissenhorn.

Soutenue en 2008

à l'Université Joseph Fourier (Grenoble) .

    mots clés mots clés


  • Résumé

    Alix est une protéine adaptatrice impliquée dans plusieurs processus intracellulaires, dont l'apoptose, l'endocytose et le trafic membranaire, le bourgeonnement de certains rétrovirus (ex. HIV-1, EIAV) à travers la membrane plasmique ou encore la cytokinèse. Alix est constituée de trois domaines majeurs: un domaine BRO N-terminal, un domaine spécifique « en V » central (Alix-V) et un domaine C-terminal riche en prolines (PRD). Nous avons montré que la forme tronquée en C-terminal au niveau du domaine PRD (Alix-PRD) formait des monomères et des dimères en solution, et que le domaine Alix-V était suffisant pour permettre cette dimérisation. La diffraction de rayons X aux petits angles (SAXS) a montré que Alix-PRD se structurait en une forme incurvée et allongée qui rappelle les domaines BAR impliqués dans les phénomènes d'incurvation de membrane. Bien que l'interaction d'Alix avec la membrane ait été mise en évidence in vitro, sa capacité à déformer la membrane doit encore être confirmée. En outre, nous avons déterminé lors d'expériences de microcalorimétrie que les formes monomériques et dimériques de Alix-V interagissent avec un peptide dérivé de la protéine p9 EIAV Gag avec une affinité de l'ordre du micromolaire. Des cristaux de la forme dimérique de Alix-V ont été obtenus. Ces cristaux présentaient un faible pouvoir de diffraction (10Å). En revanche, des cristaux diffractant à 3Å ont été obtenus à partir d'une forme mutante de Alix-V (Mut1) incapable de dimériser et qui se structure en une forme monomérique ouverte et allongée ; la résolution de cette structure est en cours. De plus, nous avons montré que l'absence de relarguage des particules virales (VLP) après surexpression de la forme humaine de Alix-Bro (résidus 358-868) pouvait être rétablie à partir de la version Mut1 de cette forme, ce qui suggère donc un rôle de cette dimérisation dans le relarguage des VLP. La protéine Alix-V dimérique a également été utilisée pour produire un antisérum Alix, qui a montré que la protéine endogène Alix pouvait être co-localiser avec les endosomes de recyclage. Enfin, nous avons montré que CHMP4B formant des structures polymériques en anneaux, pouvait interagir avec Alix. L'ensemble de ces résultats donne de nouvelles informations sur la flexibilité conformationnelle d'Alix et, associée avec CHMP4, sur son implication dans les processus de bourgeonnement membranaire. Ce travail définit également le cadre des futures analyses fonctionnelles visant à définir le rôle de la protéine dimérique Alix dans les cellules infectées par le virus HIV-1.


  • Résumé

    Alix is an adaptor protein involved in several cellular processes including apoptosis, endocytic membrane trafficking, budding of retroviruses (e. G. HIV-1, EIAV) and cytokinesis. Alix is organized in three major domains: an N-terminal BRO domain, a V-shaped domain in the middle (Alix-V) and a C-terminal proline rich domain (PRD). We have shown that a C-terminal truncated form lacking the PRD (Alix-PRD) forms monomers and dimers in solution and that the V-shaped domain is sufficient to mediate dimerization. Small angle X-ray scattering analyses revealed that Alix-PRD folds into an elongated curved structure that resembles membrane bending BAR domains. Although we determined that Alix interacts efficiently with membranes in vitro its potential deformation capability has yet to be confirmed. We further determined by isothermal titration calorimetry measurements that both monomeric and dimeric Alix-V interact with a peptide derived from EIAV Gag p9 with micromolar affinities. We obtained crystals of dimeric Alix-V which, however, diffracted X-rays no better than 10Å. We further crystallized a mutant of Alix-V (Mut1) that no longer dimerizes and folds into an open elongated monomeric structure as determined by small angle X-ray scattering. The crystals diffracted X-rays to 3Å resolution and structure determination is underway. Moreover, we showed that the deficient release of virus-like particles (VLP) upon overexpression of a human Alix-Bro form (residues 358-868), was rescued by generating a Mut1 version of this form, thus suggesting a role for dimerization in viral release. Dimeric Alix-V was also used to produce an Alix antiserum, which showed that endogenous Alix co-localizes with recycling endosomes. Finally, we showed that CHMP4B forms polymeric ring-like structures that are able to bind Alix. Together our data give insight into the conformational flexibility of Alix and its potential implications in concert with CHMP4 ring-like polymers in membrane budding processes. Our work also provides the framework for further functional analyses on the physiological relevance of dimeric Alix namely in HIV-1 infected cells.

Consulter en bibliothèque

La version de soutenance existe sous forme papier

Informations

  • Détails : 1 vol. ( 185 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. 218 réf.

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Service interétablissements de Documentation (Saint-Martin d'Hères, Isère). Bibliothèque universitaire de Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TS08/GRE1/0129/D
  • Bibliothèque : Service interétablissements de Documentation (Saint-Martin d'Hères, Isère). Bibliothèque universitaire de Sciences.
  • Disponible sous forme de reproduction pour le PEB
  • Cote : TS08/GRE1/0129
Voir dans le Sudoc, catalogue collectif des bibliothèques de l'enseignement supérieur et de la recherche.