Tests immunologiques miniaturisés pour le développement de puces à peptides et à protéines

par Graziella Khoury

Thèse de doctorat en Chimie et chimie physique

Sous la direction de Jean-Pierre Cloarec.

Soutenue en 2008

à l'Ecully, Ecole centrale de Lyon .


  • Résumé

    La technologie des puces à peptides et à protéines a connu un grand essor dans le domaine de la recherche biomédicale et le diagnostic. Elle permet l’identification et l’analyse en parallèle de centaines, voire de milliers d’interactions intermoléculaires entre des biomolécules sondes (ex : antigène : peptides, protéines) et leurs cibles (ex : anticorps), présentes dans un milieu biologique complexe, comme le sérum. Ce travail de thèse consiste à explorer de nouvelles voies de fabrication de puces à peptides et à protéines, en utilisant une méthode de détection par fluorescence. Différentes chimies de surface ont été testées pour la fonctionnalisation des lames de verre. Des immunoessais miniaturisés ont été effectués sur puces pour la détection d’anticorps anti-histones dans le sérum de patients atteints d’une maladie auto-immune, le lupus érythémateux systémique (LES). Les performances analytiques de ces tests ont été comparées à celles des techniques immunologiques classiques, comme l’ELISA et le Western blot. Les puces à peptides ont été développées en vue de fabriquer à terme des librairies de peptides synthétiques sur support solide (synthèse in situ). L’optimisation des conditions de déprotection de peptides sur puce (étape clé de la synthèse in situ) a d’abord été effectuée sur un peptide, fragment de protéine histone H3, présynthétisé sur résine et protégé au niveau de sa chaîne latérale. Ce peptide a été immobilisé (par voie ex situ) et déprotégé à l’acide trifluoroacétique (TFA) sur support de verre aminé. La déprotection dans une solution d’acide concentré a permis de conserver la stabilité des surfaces fonctionnalisées, et de conférer au peptide déprotégé son interaction biologique avec un anticorps anti-histone H3 peptide. Ces résultats corrélaient avec ceux obtenus en ELISA entre le peptide présynthétisé protégé ou déprotégé sur résine et l’anticorps spécifique. Le même peptide a été ensuite synthétisé sur supports Si/SiO2 aminés. Les surfaces ont conservé une bonne stabilité vis-à-vis des différents traitements effectués au cours de la synthèse et après la déprotection finale du peptide sur le support. Cependant, l’activité biologique du peptide synthétisé in situ doit être davantage étudiée, et le peptide doit être clivé et caractérisé par des techniques analytiques, comme la spectrométrie de masse. Les puces à protéines ont été élaborées en testant deux chimies de surface pour l’immobilisation de protéines histones : surface NHS (N-hydroxysuccinimide) ester et surface aminée modifiée avec le copolymère AMMVE (Anhydride Maléique-alt-Méthyl Vinyl Ether). Les immunoessais effectués sur les lames AMMVE ont permis d’atteindre un seuil inférieur de détection de l’anticorps commercial 50 fois plus bas que celui atteint en ELISA. Par ailleurs le volume d’analyte utilisé avec les immunoessais sur verre ont été réduits d’un facteur 100 par rapport à un ELISA classique. Les lames AMMVE ont été utilisées pour analyser des sérums humains issus de patients atteints de LES. Les tests effectués sur verre AMMVE étaient plus sensibles que les immunoessais classiques ELISA et Western blot.

  • Titre traduit

    Miniaturized immunoassays for peptide and protein microarrays development


  • Résumé

    Peptide and protein microarrays technology has shown great advancements in the field of biomedical research and diagnosis. It allows parallel analysis of multiple biomolecular interactions between probes (e. G. Antigen: peptide, protein) and their targets, present in a complexe biological sample, such as serum. This work consists to explore new methods for peptide and protein microarrays implementation, using fluorescent detection. Different surface chemistries have been developed to functionalize glass slides for the immobilization of peptide or proteins. Miniaturized immunoassays have been realized on microarrays for the detection of anti-histones antibodies in the sera of patients with auto-immune disease, the systemic lupus erythematosus (SLE). Analytical performances of these tests were compared with those of classical immunoassays, such as ELISA and Western blot. The aim of peptide microarrays development is to elaborate peptide libraries on solid support by in situ peptide synthesis. One of the key points of in situ synthesis is the final deprotection of the peptide on the support. This step was first optimized using a presynthesized side chain protected peptide, a fragment of histone H3 protein, presynthesized on resin. The peptide was immobilized onto amino functionalized glass surface by activation of its C-terminus (ex situ immobilization). The deprotection was carried out by using concentrated trifluoroacetic acid solution (TFA). This protocol allowed to conserve the stability of functionalized surfaces, and the biological interaction of the deprotected peptide with anti-histone H3 antibody. These results correlated with those obtained in classical ELISA between the specific antibody and the presynthesized protected peptide, versus non protected peptide. The same peptide epitope was then synthesized in situ on Si/SiO2 aminated support. The surface showed good stability after different synthesis cycles and acid deprotection on the substrate. However, the biological activity of the peptide synthesized in situ should be further studied, and the peptide should be cleaved and characterized with analytical tools, such as mass spectrometry. We also evaluated the performances of our protein microarrays for the detection of anti-histone antibodies in human serum of patients with SLE. We tested two surface chemistries for the immobilization of histone proteins: NHS ester surface and aminated surface modified with Maleic Anhydride-alt-Methyl Vinyl Ether (MAMVE) copolymer. The performances of our miniaturized immunoassays were compared to those of classical ELISA and Western blot. Results indicated that low detection limit obtained on MAMVE surfaces with commercial anti-histone antibody was 50 fold better than that of classical ELISA. Furthermore, 100 times less volume of biological materials are required. Our miniaturized immunoassays were more sensitive than ELISA and Western blot for the detection of anti-histone antibodies in human serum.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (236p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : 173 références

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  • Bibliothèque : Ecole centrale de Lyon. Bibliothèque Michel Serres.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : T2105
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