Dissection génétique du récepteur pour l'antigène des lymphocytes T : codage proximal et conversion du signal "ligand", de sa reconnaissance à l'assemblage des signalisomes

par Michaël Mingueneau

Thèse de doctorat en Biologie des eucaryotes. Immunologie

Sous la direction de Bernard Malissen et de Marie Malissen.


  • Résumé

    Les mécanismes associés à l’encodage du signal « ligand » par le TCR, en particulier les mécanismes d’initiation et de clôture ainsi que les mécanismes d’ajustement de ce codage au cours de la « vie lymphocytaire » font l’objet de ce travail. Deux modèles majeurs ont été proposés pour rendre compte de l’initiation des événements d’activation suite à la reconnaissance du ligand pMHC. Dans le premier modèle dit cinétique, les paramètres cinétiques, en particulier le temps de demi‐vie de l’interaction TCR:ligand, constitue le paramètre crucial gouvernant l’activation T. Dans le second modèle, les événements conformationnels sont proposés comme des événements initiateurs de l’activation. En particulier, l’une des observations majeures récemment rapportée en faveur du modèle conformationnel est l’exposition inductible d’une séquence riche en prolines du domaine intracytoplasmique de la sous‐unité CD3ε du complexe récepteur (CD3εPRS) suite à son engagement avec un ligand activateur. Selon cette hypothèse, l’exposition de cette séquence interviendrait avant tout événement de phosphorylation et permettrait le recrutement de l’adaptateur cytosolique NCK. Afin d’évaluer l’importance physiologique de l’exposition inductible de cette séquence pour l’activation T, nous avons développé une souris knock‐in exprimant une sous‐unité CD3ε dépourvue de motif riche en prolines. L’analyse du phénotype de cette souris a mis en évidence que cette séquence n’est pas nécessaire à l’activation des cellules T et a ainsi invalidé un des arguments expérimentaux majeurs en faveur du modèle conformationnel. En outre, de façon inattendue, cette souris a révélé un élément nouveau dans le codage du signal. En effet, l’absence de cette séquence conduit à des défauts partiels lors de la sélection β et de la sélection γδ, à des niveaux de TCR sélectivement augmentés en surface des thymocytes CD4+CD8+ ainsi qu’à des défauts de sélection positive. La dissection génétique et moléculaire de ce phénotype a montré que ces quatre fonctions sont associées à la colocalisation des kinases LCK au voisinage du TCR via le recrutement constitutif de NCK au niveau de la séquence riche en prolines de CD3ε et une interaction NCK:LCK. Bien que cette dernière interaction reste à démontrer directement, la compensation du phénotype par une kinase LCK pré‐activée suggère fortement que les fonctions associées à l’interaction CD3ε:NCK sont médiées par LCK. Ces observations nous ont conduits à proposer un modèle dans lequel l’interaction tripartite CD3ε:NCK:LCK constituerait un co‐récepteur intracellulaire assurant le couplage des sous‐unités du TCR avec la kinase LCK dans les situations où les co‐récepteurs CD4 et CD8 ne sont pas ou peu efficacement couplés au récepteur T, i. E. Lors de la sélection β, de la sélection γδ, dans les thymocytes CD4+CD8+ pré‐sélectionnés et lors des événements de sélection positive au cours desquels le récepteur T reconnaît des ligands de faible affinité, peu efficaces pour médier le recrutement des co‐récepteurs. L’analyse précise de la fonction de la séquence CD3εPRS dans la régulation des niveaux de TCR exprimés par les thymocytes CD4+CD8+ a montré que cette séquence participe, en coopération avec SLAP et c‐CBL, à la dégradation de CD3ζ. Afin d’analyser les mécanismes de clôture des signaux d’activation, nous avons utilisé le modèle murin LatY136F/Y136F qui présente un adaptateur LAT dépourvu de la tyrosine 136 et qui développe une lymphoprolifération T CD4+. Pour élucider les mécanismes associés à cette dérégulation, nous avons développé un système d’expression conditionnelle de la mutation dans les cellules T périphériques. Cette approche a prouvé que la pathologie lymphoproliférative n’est pas de nature auto‐immune et qu’une pathologie similaire se développe en l’absence complète d’adaptateur LAT, démontrant que les signaux générés par l’adaptateur LAT altéré ne constituent pas des événements initiateurs de la pathologie. L’existence d’événements de signalisation alternatifs dans les cellules dépourvues d’adaptateur LAT a mis en évidence de façon directe le rôle de LAT dans la terminaison et la régulation négative des signaux d’activation.

  • Titre traduit

    Genetic dissection of the cell receptor : proximal encoding and conversion of ligand recognition events into intracellular signals and signalisome assembly


  • Résumé

    The mechanisms by which ligand recognition is encoded and converted into a cytoplasmic signal by the T cell receptor (TCR), in particular how signals are initiated and terminated and how this code is adjusted during T cell differenciation are central themes in T cell immunology and constitute the subject of this work. Two main models have been proposed to account for signal initiation following ligand recognition by the TCR. In one model of T cell activation, the half‐lives of TCR:pMHC complexes constitute the main parameter driving T cell activation. In an alternative model, conformational changes of the receptor have been proposed to rationalize the seminal events leading to biochemical cascades. In particular, in one of the most recently advocated conformational model of T cell activation, a proline‐rich motif (PRS) located in the cytoplasmic tail of CD3ε has been proposed to be inducibly exposed following activation and to recruit the cytosolic adaptor NCK. According to that model, this step would occur even prior to phosphorylation events and would constitute a critical step for T cell activation. To assess this model, we constructed a knock‐in mouse deprived of this sequence. The phenotype of this mouse invalidated the conformational model of T cell activation based on an inducible exposure of this motif. Unexpectedly this mouse also unraveled novel functions for the PRS sequence at the β selection checkpoint, but also during γδ selection events and turned out to be a crucial regulator of TCR levels expressed on DP thymocytes and also required for positive selection events. These four functions were linked to the constitutive interaction between CD3εPRS and NCK and to the recruitment of LCK by NCK. Although this last interaction has to be directly demonstrated, the compensation of the phenotype by a pre‐activated LCK kinase strongly suggests that the functions associated with CD3εPRS:NCK interaction are mediated through LCK. These observations led us to formulate a model in which a tri‐molecular complex composed of CD3εPRS:NCK:LCK constitutes an intracellular coreceptor recruiting LCK in situations where the TCR is not or not efficiently coupled with CD4 and CD8 coreceptors, i. E. During β selection, γδ selection, in pre‐selected CD4+CD8+ thymocytes and during positive selection (where thymocytes recognize low‐affinity ligands that do not recruit efficiently the coreceptors due to the short half‐life of these ligands). Lastly, the function associated with the CD3εPRS in CD4+CD8+ thymocytes was linked to the participation of this sequence to a degradation pathway mediated by SLAP and c‐CBL leading to CD3ζ ubiquitination and degradation. In order to analyze signals that participate to the termination of activatory signals, we used the LatY136F/Y136F mouse genetic model in which the LAT adaptor is deprived of the tyrosine 136 and which develops a CD4 lymphoproliferative disorder. To understand the mechanisms at play in this pathology, we developed a conditional model allowing the expression of the mutation in peripheral T cells. This approach demonstrated that this disorder is not mediated by an auto‐immune mechanism and that a similar pathology occurs in complete absence of LAT adaptor, suggesting that altered LAT signals do not participate to the unfolding of the disease. Interestingly, the absence of LAT molecules led to the exacerbation of some of the biochemical events, unraveling in a direct fashion the negative regulatory function of LAT for T cell homeostasis.

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  • Détails : 1 vol. (237 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p.219-237

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  • Bibliothèque : Université Aix-Marseille (Marseille. Luminy). Service commun de la documentation. Bibliothèque de sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 48261LTH
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